PASTA激酶信号通过直接抑制UDP-N-乙酰葡糖胺1-羧基乙烯转移酶活性调控粪肠球菌肽聚糖合成

这篇研究揭示了粪肠球菌(Enterococcus faecalis)中PASTA激酶IreK通过磷酸化调节蛋白IreB，直接抑制次级UNAG-CTase(MurAB)活性的新机制。该发现不仅拓展了IreK-IreB信号轴的作用靶点，首次阐明MurAB同源物的调控方式，更为理解革兰阳性菌协调肽聚糖(PG)合成与细胞壁应激响应的分子机制提供了关键见解。

　　

ABSTRACT
肽聚糖(PG)作为细菌细胞壁的关键网状聚合物，其合成的精确调控对细胞生长、分裂和应激响应至关重要。革兰阳性菌(Firmicutes)普遍编码两种UNAG-CTase同源酶：主要同源酶MurAA和次要同源酶MurAB。既往研究表明PASTA激酶通过IreB调控MurAA的蛋白酶解，但MurAB的调控机制一直未知。本研究以机会致病菌粪肠球菌为模型，发现IreK介导的IreB磷酸化不仅能解除对MurAA的降解，还可通过直接物理相互作用抑制MurAB的催化活性，从而实现对PG合成的双重调控。

INTRODUCTION
肽聚糖合成途径的第一步由UDP-N-乙酰葡糖胺1-羧基乙烯转移酶(UNAG-CTase)催化，该步骤在多种细菌中具有重要调控意义。与多数变形菌门细菌不同，厚壁菌门(Firmicutes)进化出两个UNAG-CTase同源基因：与变形菌MurA更相似的MurAA（又称MurA1）和独特的MurAB（又称MurZ）。粪肠球菌作为医院获得性感染的重要病原体，其PASTA激酶IreK通过磷酸化底物IreB调控MurAA的ClpCP蛋白酶解，但MurAB的生物学功能及其调控机制仍是未解之谜。

RESULTS
IreK-IreB信号轴对MurAB的调控
遗传学实验发现murAA与ireK基因存在合成致死效应，暗示IreK除调控MurAA外还有其他关键靶点。使用激酶抑制剂星形孢菌素(STSP)处理ΔmurAA菌株时，生长严重受损，而ΔmurAA ΔireB双敲除菌株则不受影响，证实IreB在MurAA缺失背景下通过未知机制维持细胞存活。

体外酶活实验显示，未磷酸化的IreB能直接抑制MurAB活性（降低25%反应速率），而IreK磷酸化的IreB或D50A突变体则丧失抑制作用。AlphaFold3建模预测IreB二聚体通过D50残基与MurAB形成高置信度(pTM=0.86)相互作用界面，细菌双杂交和热位移实验证实该位点对蛋白互作的关键作用。

生理功能验证
¹⁴C-GlcNAc掺入实验表明，STSP处理显著降低ΔmurAA菌株的PG合成速率，而ΔireB突变可恢复合成能力。细胞壁完整性检测显示，IreB缺失或MurAB过表达均导致氯酚红半乳糖苷(CPRG)水解增加，证实调控失衡会破坏细胞包膜完整性。竞争实验进一步证明，失去IreB调控的MurAA/MurAB过表达菌株在共培养中被野生型迅速淘汰，凸显该调控系统对细菌适应性的重要性。

DISCUSSION
该研究建立了PASTA激酶信号调控PG合成的新范式：IreB作为"分子开关"通过两种机制协调UNAG-CTase活性——促进MurAA的蛋白酶解和直接抑制MurAB酶活。这种双重调控使细菌能在稳态下储备PG合成潜力，在遭遇细胞壁应激时通过IreK激活快速动员MurAA/MurAB。特别值得注意的是，肺炎链球菌等缺乏MurAA蛋白酶解调控的菌种可能采用类似的直接酶活调控机制，暗示该发现具有广泛生物学意义。

MATERIALS AND METHODS
研究采用分子遗传学（基因敲除、细菌双杂交）、生物化学（蛋白质纯化、酶活测定）和生物物理学（AlphaFold3建模、热位移分析）等多学科方法。关键实验包括：使用pJH086载体构建突变株；Ni柱纯化His₆-SUMO标签蛋白；通过钼酸盐法检测UNAG-CTase释放的无机磷酸盐；SYPRO Orange染料监测蛋白互作引起的熔解温度变化等。所有实验均设置生物学重复以确保结果可靠性。

ACKNOWLEDGMENTS
研究受NIH AI134660和AI175261项目资助，威斯康星医学院微生物免疫学系提供生物渲染技术支持，蛋白质相互作用模型通过UCSF ChimeraX完成可视化分析。