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本文聚焦 NLRP11 在巨噬细胞感染分枝杆菌时的作用。研究发现，NLRP11 参与经典 NLRP3 和非经典炎症小体激活，其 NACHT 和 LRR 结构域至关重要。该研究拓展了 NLRP11 和 caspase - 4 识别病原体范围，为免疫研究提供新思路。
NLRP11 在炎症小体激活中的研究背景
细胞内病原体可被宿主细胞胞质中的核苷酸结合寡聚化结构域和富含亮氨酸重复序列的受体（NLRs）或黑色素瘤缺失 2 样受体（ALRs）识别，进而触发炎症小体复合物的激活。炎症小体复合物通常包含相应的 NLR 或 ALR、衔接蛋白（ASC）和前半胱天冬酶 - 1（pro - caspase - 1） 。激活后的炎症小体复合物中，活性半胱天冬酶 - 1（caspase - 1）可切割前白细胞介素 - 1β（pro - IL - 1β）生成成熟的 IL - 1β ，还能切割 gasdermin D（GSDMD），释放 N 端（GSDMD - N，GSDMD p30）片段，在细胞膜上形成孔道，使 IL - 1β 得以排出细胞。这一过程最终激活 NINJ1，导致质膜破裂，完成细胞焦亡，这是一种特异性的炎症性细胞死亡形式。
经典 NLRP3 炎症小体的激活可由多种细胞内应激因素触发，比如钾离子外流（伴随 GSDMD 孔形成或细胞接触特定细菌毒素损伤细胞膜时发生）、活性氧物种增加（细胞对细胞内细菌的常见反应）。非经典炎症小体途径则依赖炎症性前半胱天冬酶 - 4 / 半胱天冬酶 - 5（人类）或其小鼠同源物前半胱天冬酶 - 11 对脂多糖（LPS）的识别。LPS 结合会导致半胱天冬酶激活，随后切割 GSDMD，产生的 GSDMD - N 孔促进 K?外流，进而触发 NLRP3 炎症小体激活。人类表达 NLRP11，它对细胞内 LPS 引发的非经典炎症小体有效激活以及经典 NLRP3 炎症小体激活均十分关键。
结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）是一种适应人类的兼性细胞内病原体，可激活感染巨噬细胞的 NLRP3 炎症小体。IL - 1β 在宿主对结核分枝杆菌感染的保护性反应中意义重大，但结核分枝杆菌进化出了逃避宿主细胞炎症小体识别的机制。例如，结核分枝杆菌的磷脂磷酸酶（PtpB）可切割细胞膜磷脂酰肌醇 - 4 - 磷酸，减少 GSDMD - N 插入质膜，限制细胞焦亡和 IL - 1β 分泌；蛋白激酶（PknF）通过未知机制限制 NLRP3 炎症小体激活；Rv3364c 蛋白抑制宿主组织蛋白酶 G 激活，降低炎症小体激活。尽管存在这些抑制机制，宿主巨噬细胞仍能通过激活 NLRP3 炎症小体感知细胞内的结核分枝杆菌。结核分枝杆菌是一种抗酸杆菌，不表达 LPS，但其具有由分枝杆菌脂质和脂蛋白组成的外膜，结构较为特殊。鉴于结核分枝杆菌是适应人类的病原体，而 NLRP11 仅在灵长类动物中表达，研究人员推测 NLRP11 可能参与对分枝杆菌的识别。
NLRP11 对人类巨噬细胞中经典 NLRP3 炎症小体激活的必要性
研究人员此前发现，缺乏 NLRP11 的 NACHT 和 LRR 结构域编码序列的细胞，在对胞质 LPS 的非经典炎症小体激活方面存在缺陷。为进一步评估 NLRP11 对先天免疫信号传导的作用，研究人员利用 CRISPR - Cas9 技术，在人 THP - 1 单核细胞中构建了一系列 NLRP11 结构域缺失突变体，包括删除 NLRP11 的 pyrin 结构域（PYD）（NLRP11ΔPYD）、NACHT 和 LRR 结构域（NLRP11ΔN_LRR）或整个 NLRP11 编码序列（NLRP11?/?） 。
研究人员用 NLRP3 激动剂尼日利亚菌素处理巨噬细胞后发现，在核糖核蛋白生成的 NLRP11?/?巨噬细胞中，尽管 NLRP3 水平未降低，但与野生型（WT）巨噬细胞相比，细胞死亡显著减少。同时，caspase - 1 的激活（涉及活性结构域的切割和释放）和 GSDMD 的激活（涉及切割）在 NLRP11?/?巨噬细胞中均显著降低，促炎细胞因子 IL - 1β 的释放也减少。用 NLRP3 抑制剂 MCC950 处理细胞后，尼日利亚菌素诱导的细胞死亡、caspase - 1 和 GSDMD 的加工以及 IL - 1β 和 IL - 18 的释放均恢复到模拟处理的 THP - 1 细胞水平，表明上述表型是由 NLRP3 激活引起的。
NACHT 和 / 或 LRR 结构域对 NLRP11 依赖的 NLRP3 炎症小体激活的重要性
为探究 NLRP11 特定结构域对 NLRP3 信号传导的影响，研究人员评估了核糖核蛋白生成的 NLRP11ΔPYD和 NLRP11ΔN_LRR巨噬细胞中细胞死亡和细胞因子释放的激活情况。结果显示，删除 NACHT 和 LRR 结构域会导致尼日利亚菌素诱导的细胞死亡减少，IL - 1β 释放降低，同时 caspase - 1 和 GSDMD 的加工也显著减少；而单独删除 PYD 结构域则无此影响，caspase - 1 的激活水平与 NLRP11+/+巨噬细胞相似，GSDMD 的激活仅轻度降低。这表明 NLRP11 的 NACHT 和 / 或 LRR 结构域对 NLRP3 炎症小体的有效激活至关重要，且 NLRP11 参与 NLRP3 激活并不严格依赖其 pyrin 结构域。
研究还发现，在整合了 Cas9 的 NLRP11ΔN_LRR巨噬细胞（NLRP11ΔN_LRR[Cas9]）中，尼日利亚菌素对 NLRP3 的激活未受影响，这与未整合 Cas9 的 NLRP11ΔN_LRR巨噬细胞情况不同。这表明在 NLRP3 信号传导方面，Cas9 整合细胞系中 NLRP11 的 NACHT 和 LRR 结构域缺失对 NLRP3 无影响，可能并非因为 NLRP11 pyrin 结构域的存在，而是由于非 NLRP11 基因变化，提示 Cas9 长期存在导致的基因组水平变化可能促成了这一表型。
抗酸菌结核分枝杆菌感染激活 NLRP3 炎症小体依赖 NLRP11
此前，NLRP11 是否参与抗酸菌或其他革兰氏阳性菌的识别以及引发细胞炎症反应尚未有研究。已知 THP - 1 巨噬细胞感染结核分枝杆菌产生的 IL - 1β 依赖 NLRP3，且 NLRP11 在 NLRP3 激活过程中会被招募。因此，研究人员推测在感染结核分枝杆菌的 NLRP11?/?THP - 1 巨噬细胞中，IL - 1β 的产生可能低于 WT 巨噬细胞。
实验结果显示，在感染 8 小时和 24 小时时，NLRP11?/?巨噬细胞释放的 IL - 1β 明显少于 WT 巨噬细胞。用 MCC950 处理感染细胞后，NLRP11?/?巨噬细胞中 IL - 1β 的释放进一步减少，表明 IL - 1β 释放依赖 NLRP3，可能是直接或间接依赖。
对于与结核分枝杆菌亲缘关系较近的机会致病菌堪萨斯分枝杆菌（M. kansasii），THP - 1 巨噬细胞感染后产生的 IL - 1β 同样依赖 NLRP3。感染堪萨斯分枝杆菌时，IL - 1β 的释放依赖 NLRP11，在感染后期，细胞死亡也部分依赖 NLRP11 。在感染 1、2、4 和 6 小时时，NLRP11?/?巨噬细胞释放的 IL - 1β 显著减少，在 6 小时时细胞死亡明显降低。
NLRP11 的 NACHT 和 LRR 结构域对革兰氏阴性菌福氏志贺菌激活非经典炎症小体的必要性
研究人员之前发现，NLRP11 对多种革兰氏阴性菌（包括福氏志贺菌）感染时非经典炎症小体的激活至关重要。在福氏志贺菌感染实验中，删除 PYD 结构域不影响细胞死亡，而删除 NACHT 和 LRR 结构域或整个 NLRP11 基因座会使巨噬细胞死亡减少 40% - 50% 。同时，缺乏 NACHT 和 LRR 结构域（NLRP11ΔN_LRR）或整个 NLRP11（NLRP11?/?）的巨噬细胞中，促炎细胞因子 IL - 1β 和 IL - 18 的释放最多可减少 10 倍，而仅缺乏 PYD 结构域（NLRP11ΔPYD）的巨噬细胞则无此现象。
进一步研究发现，NLRP11ΔN_LRR和 NLRP11?/?巨噬细胞中 caspase - 4 的激活降低约 2 倍，GSDMD 的加工也显著减少，而 NLRP11ΔPYD巨噬细胞中二者未受影响，且各细胞中全长 pro - caspase - 4 和全长 GSDMD 的水平未改变。这表明 NACHT 和 / 或 LRR 结构域对福氏志贺菌感染时 NLRP11 依赖的非经典炎症小体的有效激活是必需的。
福氏志贺菌激活非经典炎症小体不依赖 NLRP3
为验证 NLRP11 依赖的非经典炎症小体激活是否依赖 NLRP3，研究人员用 MCC950 预处理感染福氏志贺菌的 NLRP11ΔN_LRR巨噬细胞。结果发现，MCC950 处理不影响细胞死亡、细胞因子释放以及 caspase - 4 和 GSDMD 的加工，说明 NLRP3 并非福氏志贺菌感染时 NLRP11 依赖的非经典炎症小体激活所必需。
结核分枝杆菌激活非经典炎症小体依赖 NLRP11
NLRP11ΔN_LRR（Cas9）细胞系可准确反映 NLRP11 在非经典 caspase - 4 活性中的作用，且对尼日利亚菌素刺激的 NLRP3 激活正常。研究人员比较了感染分枝杆菌的 WT（Cas9）和 NLRP11ΔN_LRR（Cas9）巨噬细胞中 IL - 1β 的释放情况。结果显示，感染结核分枝杆菌或堪萨斯分枝杆菌的 NLRP11ΔN_LRR细胞在所有时间点释放的 IL - 1β 均显著减少，而感染非致病性耻垢分枝杆菌（M. smegmatis）的细胞 IL - 1β 释放随时间增加，且 NLRP11ΔN_LRR细胞中未出现减少。这表明结核分枝杆菌和堪萨斯分枝杆菌感染时释放的 IL - 1β 至少部分依赖 NLRP11 的 NACHT 和 / 或 LRR 结构域，感染这三种分枝杆菌时细胞系间的细胞死亡无显著差异。
进一步检测堪萨斯分枝杆菌感染 WT 和 NLRP11ΔN_LRR（Cas9）巨噬细胞在 1、2、4 和 6 小时时 IL - 1β 的释放情况，发现 NLRP11ΔN_LRR巨噬细胞在每个时间点释放的 IL - 1β 均显著低于 WT 细胞，说明 NLRP11 在感染早期对 IL - 1β 释放也至关重要。
为直接验证分枝杆菌是否激活非经典炎症小体，研究人员检测了缺乏 caspase - 4 和 caspase - 5 的巨噬细胞在分枝杆菌感染时 IL - 1β 释放和细胞死亡情况。结果显示，感染堪萨斯分枝杆菌 4 小时和感染结核分枝杆菌 24 小时时，缺乏 caspase - 4 和 caspase - 5 的细胞完全没有 IL - 1β 释放。感染堪萨斯分枝杆菌时，细胞死亡减少约 2 倍至基线水平；感染结核分枝杆菌时，细胞死亡受影响较小。在 WT THP - 1 巨噬细胞中，感染结核分枝杆菌时存在少量 caspase - 4 加工和释放，且不受 MCC950 抑制 NLRP3 的影响。这些数据表明，结核分枝杆菌和堪萨斯分枝杆菌感染时 IL - 1β 的分泌依赖非经典 caspase - 4 /caspase - 5 炎症小体。
研究讨论
此前两项研究表明，NLRP11 对巨噬细胞样 THP - 1 细胞和原代人巨噬细胞中非经典 caspase - 4 /caspase - 5 炎症小体的有效激活至关重要，它参与对胞质 LPS 和革兰氏阴性菌感染的非经典炎症小体激活。本研究进一步发现，NLRP11 对抗酸菌结核分枝杆菌和堪萨斯分枝杆菌激活非经典炎症小体同样必需。
关于 NLRP11 在经典 NLRP3 炎症小体激活中的作用，此前存在相互矛盾的研究结果。本研究证实了 NLRP11 在非经典炎症小体激活中的作用，明确了 NACHT 和 / 或 LRR 结构域对 NLRP3 激活的必要性，且 NLRP3 激活不严格依赖 NLRP11 的 pyrin 结构域。研究人员推测，之前研究结果的差异可能是由于细胞系中 Cas9 整合导致的基因组不稳定，本研究新构建体通过转染 Cas9 蛋白和引导 RNA 生成，避免了相关问题，统一了该领域的研究结果，确定 NLRP11 对非经典和经典 NLRP3 炎症小体激活均不可或缺。
虽然 NLRP11 促进 NLRP3 激活的机制尚不清楚，但研究人员推测 NLRP11 可能作为辅助 NLR 发挥作用，类似哺乳动物和植物中的相关 NLR 。由于 NLRP11 在人巨噬细胞中含量极低，而 NLRP3 含量丰富，因此 NLRP11 更可能在 NLRP3 上游发挥作用，但具体机制仍需进一步研究。
小鼠中 caspase - 4 和 caspase - 5 的同源物 caspase - 11 对检测胞质 LPS 至关重要，caspase - 11?/?小鼠对大肠杆菌或 LPS 诱导的败血症休克更具抵抗力。在人类中，caspase - 4 和 / 或 caspase - 5 以及 NLRP11（小鼠中不存在）对识别胞质 LPS 至关重要。间接证据表明，革兰氏阳性菌的脂磷壁酸（LTA）也可被 caspase - 4 检测到。本研究首次证实，NLRP11 和非经典 caspase - 4 炎症小体对检测细胞内结核分枝杆菌必不可少，对于结核分枝杆菌或堪萨斯分枝杆菌感染，非经典途径对宿主炎症小体反应至关重要，因为 caspase - 4 / 5 是 IL - 1β 释放所必需的。
结核分枝杆菌既不含 LPS 也不含 LTA，那么 caspase - 4 和 / 或 NLRP11 的配体可能是什么呢？潜在配体之一是脂阿拉伯甘露聚糖（LAM），它是一种复杂糖脂，与 LPS 类似，通过脂质锚定在内膜上。不同分枝杆菌物种的 LAM 糖组成不同，这或许能解释为何结核分枝杆菌和堪萨斯分枝杆菌可诱导非经典炎症小体激活，而耻垢分枝杆菌则不能，不过 LAM 在炎症小体激活中的作用仍需进一步研究。另一种可能的配体是含 Pro - Glu 基序和 Pro - Pro - Glu 基序（PE / PPE）结构域的蛋白家族，该家族蛋白在结核分枝杆菌和堪萨斯分枝杆菌中丰富，但耻垢分枝杆菌中不存在。然而，PPE 蛋白 PPE13 可与 NLRP3 的 NACHT 或 LRR 结构域相互作用，导致 NLRP3 激活，而本研究发现 caspase - 4 /caspase - 5 缺陷的 THP - 1 细胞几乎完全没有 IL - 1β 分泌，表明结核分枝杆菌和堪萨斯分枝杆菌激活炎症小体的机制并非直接激活 NLRP3。总之，本研究拓宽了 NLRP11 和 c
