基于大肠杆菌ShoB毒素的合成抗菌肽理性设计：一种对抗抗生素耐药性的新策略

为解决抗生素耐药性(AMR)的全球性挑战，研究人员以大肠杆菌ShoB毒素为模板，通过理性设计开发出具有快速杀菌活性和低耐药倾向的合成抗菌肽(AMPs)。该研究通过截短修饰和D-氨基酸替换，获得溶解性增强且蛋白酶稳定性提升的肽类衍生物，为新型抗生素开发提供了源自毒素-抗毒素(TA)系统的独特策略。

　　

抗生素耐药性已成为威胁全球公共卫生安全的重大挑战，世界卫生组织将其列为"21世纪最紧迫的健康威胁之一"。随着"最后防线"抗生素如粘菌素和碳青霉烯类药物的失效，革兰阴性菌感染的治疗选择日益匮乏。传统抗菌肽(AMPs)虽具有快速杀菌特性，但存在易降解、溶血毒性等问题。在这一背景下，挪威奥斯陆大学和哥本哈根大学的研究团队另辟蹊径，将目光投向细菌自身携带的"分子武器库"——I型毒素-抗毒素系统(TA systems)。

该团队聚焦大肠杆菌shoB-ohsC系统中的ShoB毒素肽，通过结构改造克服其天然疏水性缺陷。研究发现，通过插入赖氨酸(K)残基优化电荷分布、截短肽链长度，并引入D-氨基酸修饰，可显著提升肽类化合物的溶解性、蛋白酶稳定性和抗菌活性。相关成果发表于《Scientific Reports》，为开发基于细菌毒素的新型抗生素提供了概念验证。

关键技术方法包括：1）微波辅助固相肽合成(SPPS)制备修饰肽段；2）微量肉汤稀释法测定最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)；3）基于pET28b载体的胞内毒性评估系统；4）波动实验(p₀法)量化耐药频率(FoR)；5）胰蛋白酶消化实验评估蛋白酶稳定性；6）溶血实验检测哺乳动物细胞毒性。使用ATCC标准菌株（包括大肠杆菌ATCC 25922等）进行活性评价。

结果与讨论

TA系统毒素的改造策略
通过AlphaFold结构预测证实，天然ShoB及其改造体1a均能形成α-螺旋。在核心疏水区插入5个赖氨酸（1a肽：MTDGRYLIKRVKKKKKAVLQLILKFL）使溶解度提升至5 mg/mL，对6种病原体的MIC达8-32 μM。精氨酸(R)替换反而降低活性（1b肽MIC升高2-4倍），可能与精氨酸的疏水性增强有关。

截短肽的活性规律
质粒表达实验显示，N端可截去10个残基（N10变异体）而保留活性，但C端仅允许5个残基缺失。对应合成肽1a-N10（VKKKKKAVLQLILKF）表现出最佳广谱活性（MIC 4-16 μM），且杀菌动力学显示0.5小时内即可将大肠杆菌降至检测限（100 CFU/mL）。

D-氨基酸修饰的效应
将1a的C端14-26位改为D型氨基酸（D-1a）后，蛋白酶稳定性显著提升。有趣的是，胰酶消化后的D-1a片段活性反而增强8倍（MIC从16 μM降至2 μM），提示特定酶切可能产生更高效的杀菌片段。全D型1a-N10（D-1a-N10）对金黄色葡萄球菌的MIC改善8倍（2 μM）。

耐药性评估
波动实验揭示，天然型肽（1a、1a-N10）的耐药频率(FoR)与粘菌素相当，而D型变体（D-1a、D-1a-N10）未检测到耐药突变。相衬显微镜观察到D型肽处理5分钟后即引起大肠杆菌膜形态改变，提示其快速膜破坏机制可能阻碍耐药性发展。

溶血毒性挑战
尽管改造肽显示出理想抗菌特性，但50 μM浓度下仍引起显著溶血（>80%）。D型修饰进一步加剧溶血现象，这成为后续优化需解决的关键问题。

结论与展望
该研究首次系统证明I型TA系统毒素可作为抗菌肽设计模板。通过理性改造获得的1a-N10等肽段兼具快速杀菌（2小时内起效）、低耐药倾向（FoR<10^-9）和结构可调等优势。尽管溶血毒性仍是临床转化的主要障碍，但该工作为开发"以菌治菌"的新型抗生素开辟了道路。作者建议未来可通过纳米制剂包裹或靶向修饰来改善选择性，同时强调TA系统蕴藏着大量未被探索的天然肽资源。这项来自北欧研究团队的创新性工作，为应对后抗生素时代的挑战提供了新的分子设计范式。