Glutamicibacter sp. ZY1：通过铁竞争对抗副溶血性弧菌的新型益生菌 “利器”

本文研究发现 Glutamicibacter sp. ZY1 可通过产生铁载体与副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）YDE17 竞争铁，从而抑制其生长。体外和体内实验均证实该抑制作用，且 ZY1 能提高受感染虾的存活率，为控制弧菌感染提供新策略。

　　

引言

中国是南美白对虾（Litopenaeus vannamei）的主要生产国，但南美白对虾极易受到弧菌属（Vibrio spp.）感染，导致大量死亡。为防治弧菌感染，抗生素曾被频繁使用，然而其带来诸多危害，如耐药基因传播、耐药菌产生和微生物生态系统破坏等，还影响动物和人类安全及水生生态系统稳定，因此急需新的防治策略。

益生菌是治疗弧菌感染的有效工具，筛选能拮抗弧菌的益生菌及明确其抑制物质至关重要。目前已知的拮抗弧菌的益生菌有芽孢杆菌属（Bacillus）、假单胞菌属（Pseudomonas）等。益生菌可通过多种方式发挥拮抗作用，如产生活性抑制物质、争夺营养、调节群体感应系统和提高宿主免疫调节能力等。其中，铁是细菌生长和生存的关键元素，在铁限制条件下，细菌可分泌铁载体（siderophores）获取铁。在水产养殖中，已有一些益生菌利用铁载体与病原体竞争铁，如链霉菌属（Streptomyces）等。

本研究旨在筛选和鉴定对多种弧菌具有抑制活性的细菌 ZY1，追踪和表征其产生的抑制物质，并从铁竞争角度探索其对 YDE17 的拮抗机制，同时通过人工感染实验确定 ZY1 对虾免受副溶血性弧菌感染的保护作用。

材料与方法

1. 细菌分离：从患病南美白对虾养殖场采集水样，过滤后将细菌接种在 2216E 琼脂平板上，培养后观察拮抗圈，纯化和鉴定抑制细菌及周围细菌。通过 PCR 扩增 16S 核糖体 RNA（16S rRNA）基因序列，并进行测序和比对，利用 MEGA 11 软件构建系统发育树。
2. Glutamicibacter sp. ZY1 的抑菌谱：采用纸片扩散法，以多种细菌为测试菌株，在 2216E 或 LB 琼脂平板上进行抑菌实验，测量抑菌圈直径。
3. ZY1 对副溶血性弧菌 YDE17 的抑制活性：用纸片扩散法，设置不同的 ZY1 和 YDE17 细胞比例，测定 ZY1 对 YDE17 的最佳抑制比例。
4. ZY1 在海水中对 YDE17 的抑制作用：将 ZY1 和 YDE17 分别培养过夜，离心获取无细胞上清液。将 YDE17 细胞悬液与不同体积的 ZY1 无细胞上清液混合，在海水中培养后计数 YDE17 细胞数量。
5. ZY1 抑制物质的表征：将 ZY1 培养过夜获取无细胞上清液，分别在不同温度、蛋白酶 K 处理和不同 pH 条件下孵育，测定抑制物质的稳定性。通过添加邻硝基苯 -β-D - 半乳糖吡喃糖苷（ONPG）评估 ZY1 无细胞上清液对 YDE17 内膜通透性的影响。
6. 铁载体水平的测定：采用铬天青 S（CAS）法在液体培养基和琼脂平板上测定细菌产生的铁载体。比较 YDE17 在有无 ZY1 无细胞上清液存在下的铁载体产生情况。
7. ZY1 和 YDE17 产生的铁载体类型的测定：分别使用 Arnow 试验、FeCl₃实验和 CAS 试验确定 ZY1 和 YDE17 产生的铁载体类型。
8. 铁对抑制活性的影响：将 ZY1 无细胞上清液与不同浓度的 FeCl₃混合，对 YDE17 进行抑菌实验，测量抑菌圈直径。
9. 铁对铁载体产生的影响：观察 YDE17 在 CAS 琼脂平板上的颜色变化，比较不同铁浓度下 YDE17 的铁载体产生情况。
10. 人工感染实验：购买健康南美白对虾，适应养殖条件后进行人工感染实验。计算 YDE17 的半数致死剂量（LD₅₀），设置不同感染组，观察虾的临床症状和死亡情况，计算存活率和相对存活率（RPS）。
11. 统计分析：所有数据均重复三次，使用 GraphPad Prism 软件进行统计分析，采用双尾无配对 Student's t 检验，数据以平均值 ± 标准差（SD）表示，设定不同的显著性水平。

结果

1. 拮抗细菌的筛选、分离和鉴定：从虾场水样中分离出 21 种可培养菌株，ZY1 对 YDE17 的抑制作用最强，其无细胞上清液也具有拮抗作用。经鉴定，YDE17 为副溶血性弧菌，与V. parahaemolyticus菌株 ATCC 17802 同源；ZY1 属于Glutamicibacter soli，与G. soli菌株 SYB2 同源。
2. Glutamicibacter sp. ZY1 的抑菌谱：ZY1 对多种细菌具有拮抗作用，包括Splendidus进化枝、Coralliilyticus进化枝等，但对Nereis进化枝、Cholerae进化枝等部分细菌无拮抗作用。
3. ZY1 对 YDE17 在不同基质中生长的抑制作用：ZY1 对 YDE17 的抑制作用呈剂量依赖性，在琼脂平板上，当 ZY1 细胞数较多且 YDE17 细胞数较少时，抑菌圈更大。在海水中，随着 ZY1 无细胞上清液体积增加，YDE17 细胞数量逐渐减少。
4. ZY1 抑制作用的表征：ZY1 无细胞上清液的抑制活性具有热稳定性、蛋白酶 K 稳定性和在 pH 6 - 10 范围内的稳定性。其可破坏 YDE17 细胞的内膜，使 β - 半乳糖苷酶泄漏，导致反应混合物颜色变黄。推测抑制物质可能是小的非蛋白质分子，可能是铁载体。
5. ZY1 通过产生铁载体竞争铁抑制 YDE17：ZY1 上清液中铁载体水平随细胞密度变化，先升高后降低，在 OD₆₀₀≈0.9 时达到最高。添加 ZY1 无细胞上清液可诱导 YDE17 分泌更多铁载体。补充 FeCl₃后，ZY1 对 YDE17 的抑制作用减弱，表明 ZY1 对 YDE17 的抑制作用主要归因于铁竞争。
6. ZY1 产生异羟肟酸和 β - 羟基羧酸盐铁载体，YDE17 产生弧菌素：通过多种实验确定，ZY1 产生异羟肟酸和 β - 羟基羧酸盐铁载体，YDE17 产生弧菌素（vibrioferrin）。随着 FeCl₃浓度增加，YDE17 的铁载体产生减少。
7. ZY1 保护虾免受 YDE17 感染：YDE17 对虾的感染实验中，虾的存活率随 YDE17 浓度增加而降低，计算得出 YDE17 的 LD₅₀为 1×10⁶ CFU/mL。单独感染 ZY1 时，虾的平均存活率为 86%；同时感染 ZY1 和 YDE17 时，虾的存活率在第 5 天达到 90%，ZY1 的 RPS 为 83.3%，表明 ZY1 能保护虾免受 YDE17 感染。添加 FeCl₃后，ZY1 对 YDE17 感染的保护作用受到影响，虾的存活率显著降低。

讨论

放线菌被认为是产生多种拮抗化合物或细胞外酶的理想益生菌候选者。Glutamicibacter属是放线菌，此前对其拮抗作用及产生的活性物质研究较少。本研究首次发现Glutamicibacter sp. ZY1 能抑制多种致病性弧菌，包括对虾高毒力的副溶血性弧菌。ZY1 的抑菌能力与细胞数量正相关。

铁载体在提高抗菌性能方面的研究备受关注，但此前未见Glutamicibacter sp. 通过产生铁载体竞争铁抑制病原体的报道。ZY1 产生的抑制物质具有热、pH 和蛋白酶 K 稳定性，类似小分子非蛋白质物质，推测为铁载体。与其他益生菌对弧菌的完全抑制作用不同，ZY1 的抑制作用不完全，可能是因为 YDE17 在铁限制条件下可产生更多铁载体以存活。

弧菌属是导致虾弧菌病的主要细菌。目前防治副溶血性弧菌感染的方法各有优缺点，如抗生素存在危害，噬菌体的裂解活性受环境影响。与常用益生菌相比，ZY1 安全性高，对热、蛋白酶 K 和 pH 稳定，且相对存活率较高，可能是预防弧菌感染的优先候选益生菌。

综上所述，ZY1 对多种弧菌具有显著抑制作用，其抑制物质经多种处理后稳定，通过产生铁载体竞争铁抑制 YDE17 生长。人工感染实验表明 ZY1 有潜力保护虾免受副溶血性弧菌感染，为水产养殖中控制弧菌感染提供了新的益生菌资源和策略。