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本文聚焦副干酪乳杆菌 DG（Lacticaseibacillus paracasei DG），通过分析不同来源的 10 个菌株，结合全基因组测序和多种表型检测，发现该菌在 10 年工业生产中遗传和表型稳定，有力证明了当前生产实践的有效性，为益生菌质量控制提供重要依据。
引言
益生菌市场中存在众多微生物菌株，部分已商业化数十年，如鼠李糖乳杆菌 GG（Lacticaseibacillus rhamnosus GG）、动物双歧杆菌乳亚种（Bifidobacterium animalis subsp. lactis）BB - 12 和副干酪乳杆菌（Lacticaseibacillus paracasei）Shirota 等。这些历史悠久的益生菌菌株，经大量体外、动物模型及临床试验研究，被认为具有多种特定功能 。但细菌基因组易在短时间内多样化，遗传漂变等因素可能影响益生菌性能。目前，关于遗传漂变对益生菌功能稳定性的影响缺乏实验数据。本研究旨在评估已商业化超 20 年的副干酪乳杆菌 DG（DSM 34154）的遗传和表型稳定性。
材料与方法
- 菌株研究：分析 10 株副干酪乳杆菌 DG 菌株，包括保藏于 DSMZ 的菌株（DG_DSMZ）、2013 - 2022 年不同批次商业产品 Enterolactis 中的 7 株（DG_1–7）、实验室保存 8 年的甘油冻存菌株（DG_glic）以及健康成人粪便分离菌株（DG_F）。采用特定引物对通过 PCR 检测菌株身份。
- DNA 提取：利用特定培养基培养菌株获取细胞生物质，经多次洗涤去除胞外多糖（EPS）后，采用一系列试剂处理，最终通过乙醇沉淀法提取 DNA。
- 全基因组测定和 SNP 检测分析：结合二代（Illumina NovaSeq 6000）和三代（PacBio 单分子实时，SMRT）测序技术进行全基因组组装。运用两种变异检测流程识别单核苷酸多态性（SNPs），并通过 PCR 扩增和 Sanger 测序验证。
- 氨基酸替换功能影响预测：使用蛋白质变异效应分析器（PROVEAN）软件评估非同义单核苷酸多态性对蛋白质功能的潜在影响。
- 抗生素抗性分析：依据欧洲食品安全局（EFSA）推荐方法，采用肉汤微量稀释法测定 10 株菌株对 8 种抗生素的最小抑菌浓度（MICs），同时利用生物信息学工具检测基因组中潜在抗生素抗性基因。
- 碳水化合物代谢分析：使用 API 50 CHL 试剂盒，按照操作说明检测菌株对 49 种碳水化合物的发酵能力。
- 模拟胃肠道转运存活分析：依据 INFOGEST 2.0 体外静态模拟胃肠道消化协议，评估菌株在模拟胃肠道环境中的存活能力。
- 免疫调节活性分析：利用稳定转染 pNiFty2 - Seap 载体的重组 Caco - 2 细胞系，检测菌株对核因子 κB（NF - κB）的激活作用，从而评估免疫调节活性。
- 自由基清除活性分析：采用 2,2 - 二苯基 - 1 - 苦基肼（DPPH）自由基清除试验，测定菌株的自由基清除能力。
- 统计分析：运用 GraphPad Prism 8 软件进行统计分析，采用 Mann - Whitney 检验和双向方差分析（ANOVA），以 P < 0.05 为具有统计学意义。
结果
- DG 菌株基因组分析：获得除 DG_7 外其他菌株的完整基因组，DG_7 仅有草图基因组。副干酪乳杆菌 DG 基因组包含一条 3,057,879 bp 的染色体和两个质粒。与参考菌株 DG_DSMZ 相比，共发现 5 个核苷酸替换，其中 4 个可能导致氨基酸替换，1 个位于假定非编码区。PROVEAN 分析显示，仅 DG_glic 中假定 Mscl 蛋白的 N37K 替换为有害，其余非编码区及部分替换为中性。
- DG 菌株表型和功能特征
- 抗生素抗性谱：10 株菌株抗生素抗性无显著差异，对庆大霉素和卡那霉素的抗性略高于 EFSA 阈值，但未发现已知可传播的抗生素抗性基因，推测该抗性为菌株固有特征。
- 碳水化合物代谢谱：所有菌株碳水化合物利用谱相同，均能代谢部分糖类，对部分底物呈弱阳性反应，其余 22 种底物不能代谢。
- 模拟胃肠道转运存活情况：10 株菌株在模拟胃肠道转运过程中的存活能力相似，均有一定程度的减少，但无显著差异。
- 免疫调节活性：所有 DG 菌株均能显著降低 NF - κB 激活，且菌株间无显著差异。
- 自由基清除活性：高浓度细菌细胞（100 亿个）的自由基清除活性与阳性对照相当，各菌株间无显著差异。
讨论
商业化益生菌菌株需保证生产批次间微生物细胞相同，但工业生产可能导致 DNA 突变和遗传漂变，影响益生菌性能。关于遗传漂变对工业益生菌的影响存在两种理论假设：一是大种群生产可降低遗传漂变影响；二是工业培养条件可能增加非同义替换和核苷酸缺失率。此前对益生菌遗传漂变研究较少，如鼠李糖乳杆菌 GG 虽有遗传变异报道，但不同研究结论存在差异。本研究中，副干酪乳杆菌 DG 在体外模拟胃肠道消化中存活能力良好，各菌株间无显著差异。抗生素抗性方面，其对庆大霉素和卡那霉素的抗性可能为固有特征。与其他研究中菌株碳水化合物代谢模式变化不同，本研究中 10 株 DG 菌株代谢模式无差异。在免疫调节和抗氧化性能上，各菌株也无显著差异，表明其功能稳定。本研究虽存在仅分析单个商业产品菌株的局限性，但结果仍证实该菌株在当前工业生产条件下遗传稳定，能保持益生菌特性，体现了现有生产实践的有效性。
结论
本研究表明，过去十年工业生产中的副干酪乳杆菌 DG 菌株具有高度的遗传和表型稳定性，确保了其益生菌特性的一致性，证实了当前工业生产实践的有效性，保障了含该菌株益生菌产品的健康效益。同时，强调了持续监测和质量控制对益生菌产品的重要性，建议对其他商业重要益生菌菌株开展类似研究，以提升市场上益生菌产品的可靠性。
