SARS-CoV-2 生物克隆基因组异质性研究：探寻新冠病毒进化与防控新线索

本文聚焦 SARS-CoV-2 生物克隆，发现其基因组存在异质性且包含进化分歧位点（clade-discordant residues）。通过对 USA-WA1/2020 分离株克隆测序，量化了病毒感染性变异体子代的基因组变化，为理解新冠病毒适应性和疫情防控提供重要依据。

　　

研究背景

RNA 病毒在感染个体内存在准种动力学（quasispecies dynamics），这影响着病毒的短期适应能力和疾病控制策略。对于 SARS-CoV-2，最初认为其宿主内进化有限，但后续研究发现存在广泛的宿主内遗传和功能异质性。

在研究 SARS-CoV-2 时存在一些问题。一方面，不同的超深度测序协议检测低频突变和缺失的能力不同；另一方面，病毒编码的 3′?5′核酸外切酶（Exo N）虽在体外有活性，但它对 SARS-CoV-2 错误率降低的影响尚未明确，且 SARS-CoV-2 突变率估计值处于其他 RNA 病毒范围较低水平。此外，对未分级的病毒 RNA 群体进行高分辨率超深度测序时，无法区分突变和缺失是在有活力的基因组还是缺陷病毒基因组（DVGs）中。由于 SARS-CoV-2 群体中积累了高频率的 DVGs，研究有活力基因组中的突变和缺失对了解该病毒十分关键。本研究通过对 SARS-CoV-2 生物克隆和亚克隆的 RNA 基因组测序，量化病毒群体中感染性子集的遗传损伤。

实验方法

1. 病毒、感染和生物克隆制备：SARS-CoV-2 分离株 USA-WA1/2020 最初来自美国首例确诊 COVID-19 患者。经过多次在 Vero 细胞系中的传代，获得用于实验的工作毒株。通过温和洗涤剂（0.01% 脱氧胆酸钠）处理病毒，然后在 Vero E6 细胞单层上进行连续的空斑分离，获得生物克隆（如 c10、c11、c12、c13）和亚克隆（包括第二代和第三代亚克隆）。
2. RNA 提取、SARS-CoV-2 RNA 扩增和 DNA 定量：使用 QIAmp Viral RNA Mini Kit 250 提取总 RNA，通过 Transcriptor One-Step RT-PCR kit 进行 RNA 扩增，之后对扩增产物进行凝胶电泳、纯化、定量和质量检测。
3. 病毒 RNA 定量：利用 Light Cycler RNA Master SYBR green I kit 对 SARS-CoV-2 RNA 进行定量实时 PCR（RT-qPCR），以 nsp12 编码区域为目标，通过与已知量的体外转录 SARS-CoV-2 RNA 标准曲线对比进行定量。
4. 防止样本交叉污染的措施和控制：在样本处理的各个环节采取严格措施防止交叉污染，如在样本采集、运输和实验室操作过程中，分别处理每个样本，使用生物安全柜并进行紫外线消毒，对非一次性材料进行消毒，设置阴性对照等。
5. 确定一致性序列：使用 Illumina 的 MiSeq 平台和 COVIDSeq 方法获得 USA-WA1/2020 及生物克隆和亚克隆的一致性基因组序列，通过与参考序列 Wuhan-Hu-1 比对确定突变和缺失。
6. 超深度测序：从 10 个生物亚克隆提取的 RNA 中扩增 nsp12（聚合酶）编码区域和刺突（S）编码区域的多个扩增子，进行索引、文库制备和深度测序，使用 SeekDeep 生物信息学管道处理数据，以 0.1% 的频率截止值检测突变和缺失。
7. 评估超深度测序可靠性的数据和控制：通过多种方式评估超深度测序的可靠性，包括平均清洁读数覆盖率、测序质量分数、不同频率截止值下突变检测的一致性、氨基酸取代的功能预测一致性等。
8. 统计分析：使用单因素方差分析（ANOVA）计算感染性、RNA 浓度和比感染性差异的统计学意义，使用双因素方差分析计算生长动力学差异，使用比例检验计算突变数量差异，使用 Kruskal-Wallis 检验和 Dunn 多重比较检验计算多样性指数差异。

实验结果

1. SARS-CoV-2 USA-WA1/2020 克隆和亚克隆群体的制备：成功制备了 SARS-CoV-2 USA-WA1/2020 的生物克隆和亚克隆，各克隆和亚克隆在感染滴度、病毒 RNA 量和比感染性方面存在差异，但均能获得足够的病毒 RNA 用于直接测定基因组 RNA 的一致性核苷酸序列。
2. 克隆和亚克隆群体一致性基因组序列中的突变和缺失：生物克隆的一致性基因组序列平均每个基因组有 2.5 个点突变和 0.2 个缺失，第二代亚克隆平均有 2.1 个点突变和 0.4 个缺失，第三代亚克隆平均有 2.7 个点突变和 0.4 个缺失。在基因组的 22206 - 23629 区域，突变和缺失数量较多，是变异热点区域。随着克隆和亚克隆的传代，基因组序列呈现出逐步积累突变和缺失的现象。
3. 病毒子代产生动力学和亚克隆群体突变谱复杂性：10 个第三代亚克隆感染 Vero E6 细胞后，病毒产生动力学与亲本 USA-WA1/2020 群体相似。亚克隆的 nsp12 和 S 编码区域突变谱具有独特组成，大多数突变频率在 0.10% - 0.49% 之间。与其他研究相比，SARS-CoV-2 生物亚克隆的突变谱复杂性低于鼻咽样本，且 USA-WA1/2020 在 S 编码区域的复杂性高于其亚克隆。
4. USA-WA1/2020 及其亚克隆衍生物中的进化分歧位点：在所有亚克隆中均鉴定出至少两个属于 Alpha、Beta、Gamma、Lambda 或 Omicron 谱系的进化分歧突变或缺失，表明单个 SARS-CoV-2 基因组在有限复制过程中可快速产生进化分歧位点。

讨论

1. 基因组异质性与突变率：SARS-CoV-2 克隆和亚克隆群体的一致性基因组序列平均每个有活力基因组包含 2.8 个基因组修饰，这一异质性比其他 RNA 病毒低约 6.5 倍。这可能反映出 SARS-CoV-2 的突变率较低，或者其对突变的耐受性降低，也可能是两者共同作用的结果。
2. 突变谱特征：第三代生物亚克隆子代的突变谱中，低频率突变占主导，这可能表明突变对大型基因组病毒的适应性有不利影响。生物克隆和亚克隆的一致性序列中最丰富的突变类型是 C → U，而突变谱中最丰富的是 U → C 和 A → G，这种差异可能与不同突变对病毒适应性的影响以及细胞编辑活动有关，但具体原因仍有待进一步研究。
3. 进化分歧位点的意义：生物亚克隆的突变谱中存在进化分歧位点，这些位点在病毒进化过程中可能具有重要意义。它们的存在可能是由于 SARS-CoV-2 在进化过程中对序列空间的有限占据，利用突变谱序列作为数据输入的预测算法可能有助于预测未来分离株的序列。
4. 研究局限性与展望：本研究使用 Vero E6 细胞可能存在一定局限性，如该细胞可能会使蛋白 S 的弗林蛋白酶切割位点发生突变，但研究中在该位点的突变和缺失并不多。此外，虽然突变可从 DVGs 转移到有活力基因组，但有活力基因组中突变对病毒适应性的影响更为直接。总体而言，SARS-CoV-2 克隆群体的有活力部分异质性低于其他 RNA 病毒，生物克隆可快速进化为包含进化分歧位点的复杂突变谱，这为进一步研究 SARS-CoV-2 的进化和 COVID-19 的防控提供了重要信息。