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本文通过全基因组测序（WGS）等技术分析印度 24 株布鲁氏菌（Brucella melitensis）。发现 ST8 型占主导，确定 43 个毒力基因，还揭示其遗传多样性、区域适应性等。这些成果为印度布鲁氏菌病防控及全球研究提供关键依据。
引言
布鲁氏菌（Brucella melitensis）是一种极具传染性的人畜共患病原体，可引发布鲁氏菌病，严重影响人类和牲畜健康。全球每年约有 210 万新增人类感染病例，在印度等发展中国家尤为流行，给公共卫生和经济带来巨大挑战。布鲁氏菌病常因非特异性临床表现而漏诊、误诊，其传播途径主要是接触感染动物或食用受污染的动物产品。
了解布鲁氏菌的遗传多样性和系统发育关系对防控疾病至关重要。传统研究方法存在局限性，而全基因组测序（WGS）、多位点序列分型（MLST）、泛基因组分析和全基因组系统发育等分子技术，能更深入地剖析其遗传结构和流行病学特征。此前印度在布鲁氏菌遗传多样性方面的研究较少，本研究旨在运用多种先进分子技术，分析印度分离的布鲁氏菌菌株的遗传多样性，为防控提供依据。
材料和方法
- 菌株选择：研究使用的 24 株布鲁氏菌分离株来自印度不同地区，采集时间为 2006 年至 2023 年，包括 20 株人源、1 株山羊源和 3 株绵羊源。这些菌株经初步培养、革兰氏染色、生化测试、染料抑制试验和 AMOS PCR 鉴定，以B. melitensis 16M 为阳性对照。
- 基因组 DNA 提取：用 QIAamp DNA Mini Kit 从 23 株菌株中提取基因组 DNA，通过分光光度计检测浓度和纯度，纯化后的 DNA 用于全基因组测序。
- 基因组测序、组装和注释：23 株菌株（除 VPH-17-72）在 Illumina MiSeq 平台测序，VPH-17-72 的基因组序列从 NCBI 数据库获取。使用 FastP 评估原始读数质量，Unicycler 进行从头组装，QUAST 和 BUSCO 评估组装质量，NCBI 原核基因组注释管道进行基因预测和功能注释。
- 比较基因组分析
- 数据检索：收集 24 株印度菌株和从 NCBI 下载的 38 株来自不同地区的布鲁氏菌菌株基因组数据，记录相关元数据。
- 泛基因组分析：利用 Panaroo 分析泛基因组，确定核心基因和辅助基因，FriPan 进行二维缩放和可视化。
- MLST 和毒力基因分析：运用 MLST（9 - 位点、21 - 位点和 cgMLST 方案）对菌株进行基因分型，通过 ABRicate 搜索毒力因子数据库（VFDB）预测毒力基因。
- 系统发育和全球聚类分析：parSNP 进行全基因组比对，RAxML-NG 构建系统发育树，iTOL 进行可视化和注释。
- 最小生成树分析：PyMLST 进行核心基因组多位点序列分型（cgMLST），GrapeTree 构建最小生成树（MST）。
结果
- 毒力基因：在所有测试菌株中鉴定出 43 个毒力相关基因。其中，27 个属于脂多糖（LPS）操纵子，参与细菌的入侵、细胞内存活和免疫调节；12 个与 IV 型分泌系统（virB1-virB12）相关，负责效应蛋白的分泌；还有btpA、btpB、ricA、cgs等基因，分别在免疫逃避和细胞内存活中发挥作用 。
- 多位点序列分型：基于 9 - 位点和 21 - 位点方案的 MLST 显示，所有印度布鲁氏菌分离株均为序列型 ST8。cgMLST 方案则揭示出 5 种不同的序列类型，表明该物种存在一定的遗传多样性。
- 泛基因组和系统发育：泛基因组分析发现，布鲁氏菌具有高度保守的核心基因组，包含 2899 个核心基因和 185 个软核心基因，共 3150 个基因。部分菌株如 VPH-19-03 存在独特的基因变异。印度菌株可分为 5 个不同的进化枝，大多数分离株聚集在两个主要进化枝中。系统发育树显示，印度菌株与其他国家的菌株聚类不同，表明存在不同的系统发育谱系。
- 最小生成树分析：MST 分析显示，印度菌株形成紧密相连的簇，与其他国家的菌株明显分开。印度国内不同地区的菌株也呈现出不同的聚类模式，其中 cgST 670、557、565 和 573 较为常见，cgST 670 最为普遍。
讨论
布鲁氏菌病在印度流行，绵羊和山羊的血清阳性率分别为 11.55% 和 5.37%。毒力因子基因在布鲁氏菌的致病性中起关键作用，印度菌株的毒力基因谱高度保守，与全球报道一致。泛基因组分析表明，布鲁氏菌核心基因组高度保守，但部分菌株存在独特基因谱，反映出区域适应性和进化压力。
MLST 和系统发育分析显示，印度菌株具有独特的聚类模式，与其他国家菌株遗传交换受限，可能主要由本地传播引起。MST 分析进一步证实了印度菌株的遗传相关性和地理分布模式。这些结果有助于开发更有效的诊断工具、疫苗和治疗方法。
布鲁氏菌存在基因组减少现象，丢失了一些非必需基因，如参与代谢、应激反应和调控网络的基因。这一过程使基因组更加精简，适应宿主环境，但可能会限制细菌的环境适应性。基因组减少是布鲁氏菌适应宿主的一种进化策略，影响其致病性和生存能力。
结论
综合毒力基因分析、MLST、泛基因组和系统发育分析，揭示了印度布鲁氏菌 ST8 型的遗传稳定性以及 43 个关键毒力基因的重要作用。区域适应性和进化压力导致印度菌株的遗传分化，这些发现对理解布鲁氏菌病的流行病学和全球防控策略具有重要意义，也为全球布鲁氏菌研究提供了有价值的参考。
