探秘脑膜炎奈瑟菌 B 群荚膜多糖合成启动子调控机制：HTH_XRE 转录因子的关键作用

本文聚焦脑膜炎奈瑟菌 B 群（Neisseria meningitidis serogroup B）荚膜多糖合成启动子的调控。研究发现 HTH_XRE 家族转录因子参与其中，明确了多个顺式作用元件，为深入理解细菌致病机制、优化生物材料生产及开发疗法提供重要依据。

　　

引言

脑膜炎奈瑟菌（Neisseria meningitidis）的荚膜与毒力紧密相关，也是脑膜炎球菌疫苗的重要靶点。该菌有 12 个血清群，其中 6 个（A、B、C、W、X 和 Y）可引发侵袭性疾病。在产唾液酸的血清群中，荚膜多糖的合成和运输分别由 synABCD 和 ctrABCD 操纵子负责，它们的启动子位于 134 bp 的基因间区域（NmIR）。

此前研究已发现一些调控荚膜表达的机制，如转录和翻译调控。合成操纵子的调控元件包括 UP 样元件和未知负调控元件，环境条件对荚膜产生影响不大，但 5'-UTR 区域可形成稳定发夹结构，以温度敏感方式调节翻译。此外，CrgA/LysR 转录因子结合位点、MisR/MisS 双组份调控系统也参与其中，不过仍有部分调控机制尚未明确。

结果

1. 预测结合位点和启动子：利用 Softberry BPROM 软件分析 NmIR，预测出转录因子 Fis、LexA 的结合位点以及三个 rpoD 位点，还识别出两个启动子，一个靠近 UP 样元件，另一个邻近直接重复区域。同时，通过 FIMO 软件预测出 MisR 在 synA 基因内的潜在结合位点。
2. NmIR 在大肠杆菌中的功能分析：研究在大肠杆菌中开展，结果显示携带 NmIR - GFP - pRSET 构建体的大肠杆菌 DH5α 和 BL21 (DE3) 菌株会发出荧光，且在稳定期表达量增加，而仅含 pRSET 载体的 DH5α 菌株无荧光，表明 NmIR 在大肠杆菌中具有活性。
3. 预测的控制元件在荚膜表达中的作用：对 NmIR 的不同区域进行缺失突变，发现删除 - 10 启动子框、UP 样元件、rpoD A 和 rpoD B 区域，会使 GFP 表达降低约 50%；删除预测编码 - 10 框的 LexA 区域，GFP 表达增加 47%；删除第一个重复序列，GFP 表达降低 15%；而删除 rpoD C 元件和直接重复序列对启动子活性无显著影响。
4. RNA 二级结构的作用：RNAfold 分析表明，LexA 缺失会使 5'-UTR 区域的二级结构明显不稳定，野生型的自由能为 - 15.72 kcal/mol，突变体为 - 10.07 kcal/mol。
5. 脑膜炎奈瑟菌 B 群荚膜合成操纵子启动子中的顺式调控元件：对不同血清群的基因间区域进行分析，发现产唾液酸的脑膜炎奈瑟菌血清群（B、C、W 和 Y）该区域保守，仅重复序列有差异。通过序列比对，在大肠杆菌和流感嗜血杆菌中发现保守序列，这些序列是 PhoB、rpoD 和 LexA 的潜在结合位点，且突变 rpoD 位点会降低 GFP 表达，突变 LexA 位点则会使其升高。
6. 参与荚膜合成的保守转录因子的鉴定：通过比较基因组分析，发现大肠杆菌中参与荚膜合成的三个转录因子（TypA、NusG 和 MprA），在脑膜炎奈瑟菌中有两个（TypA 和 NusG）保守。Mauve 比对显示，脑膜炎奈瑟菌 MC58 和大肠杆菌 K1 中，nusG、rpoD 和 typA 基因位于局部共线区（LCBs），且与翻译相关蛋白和 tRNA 共定位，暗示荚膜基因受翻译调控。
7. 转互补试验：将 HTH 调控因子表达质粒与 NmIR - GFP 表达质粒共转化，可增加启动子活性，但 LexA 结合位点缺失时无此现象；而与 MisR/MisS 和 NusG 表达载体共转化则会降低 GFP 表达，表明它们起抑制作用，CrgA 和 TypA 表达质粒对 GFP 荧光无显著影响。

讨论

本研究深入探究了脑膜炎奈瑟菌 B 群荚膜合成操纵子启动子的潜在调控元件。通过软件预测出多个转录因子结合位点和启动子，虽未检测到已知启动子，但突变分析证实了额外启动子的存在。

研究发现，删除 UP 样元件和相关位点会影响荚膜表达，rpoD 位点在转录起始中起重要作用。此外，MisR/MisS 双组份调控系统对荚膜表达起负调控作用，这与先前研究结果一致。

LexA 结合位点虽在脑膜炎奈瑟菌中无对应基因，但功能重要，删除该位点会增加荚膜表达。通过 BLAST 搜索鉴定出 HTH_XRE 为 LexA 的同源物，其与 NmIR - GFP 的转互补可显著增加 GFP 表达，揭示了一种新的调控机制。

其他转录因子如 Fis、CrgA、TypA 和 NusG 也参与研究。Fis 结合位点缺失对荚膜表达无影响，CrgA 同样未影响启动子活性，不过它们在脑膜炎奈瑟菌黏附上皮细胞时的调控作用仍需进一步研究。NusG 在脑膜炎奈瑟菌荚膜合成操纵子中主要作为转录终止子，TypA 对 GFP 表达无显著影响。

结论

本研究利用 GFP 荧光报告质粒，进一步明确了脑膜炎奈瑟菌荚膜表达启动子的调控机制。鉴定出多个新的转录因子结合位点，发现 HTH_XRE 是潜在的荚膜生产调控因子，其可能调节无领导 mRNA 的下游启动子。研究表明，脑膜炎奈瑟菌荚膜表达的调控涉及多种机制和转录因子，这些成果有助于提高基于荚膜多糖的生物材料生产效率。

材料和方法

1. 材料：实验所用的脑膜炎奈瑟菌 B 群菌株基因组 DNA 购自 ATCC，多种质粒、细菌培养基、工具酶及试剂盒等均有明确来源，还使用了定制 PCR 引物、共聚焦显微镜等实验材料和设备。
2. 生物信息学分析：从 GenBank 检索相关基因组序列，运用多种软件进行调控元件预测、序列比对、转录因子序列鉴定、比对结果可视化以及共线基因组区域鉴定等分析。
3. 报告载体的构建：通过 PCR 扩增、酶切、连接等步骤，构建携带 NmIR 启动子活性的报告菌株及相应突变体，用于后续实验。
4. 细菌培养：在特定条件下培养细菌，利用共聚焦显微镜和酶标仪等设备测量 GFP 强度，以评估启动子活性。
5. 转录因子构建体：从 GenBank 获取转录因子序列，经 PCR 扩增、克隆等操作构建转录因子表达载体，并进行测序验证。
6. 转互补试验：将构建的转录因子表达载体转化至携带 NmIR - GFP 或其突变体的细胞中，培养后用共聚焦显微镜成像分析。
7. 共聚焦显微镜：使用 Leica STELLARIS 5 共聚焦显微镜，在特定激光激发和发射光条件下对细菌细胞成像。
8. 统计分析：对成像数据进行统计分析，采用单因素方差分析（one - way ANOVA）评估差异显著性。