解析中枢胆碱能突触的分子组织：从果蝇模型探寻神经奥秘

本文利用果蝇（Drosophila）模型，通过体内邻近标记技术剖析了烟碱型乙酰胆碱受体（nAchRs）相关蛋白网络。研究发现 nAchR 相互作用组在发育过程中有变化，单个 nAchR 亚基缺失会引发受体亚型补偿性转变，还鉴定出关键组织者 Still life（Sif），为理解突触发育和可塑性提供依据。

　　

研究背景

神经系统进化促使突触多样化，不同突触使用不同神经递质和受体进行神经传递。在脊椎动物中，谷氨酸是主要兴奋性神经递质，中枢突触围绕谷氨酸受体（GluRs）组织；而在许多节肢动物的中枢神经系统（CNS）中，乙酰胆碱是主要神经递质，通过烟碱型乙酰胆碱受体（nAchRs）进行兴奋性神经传递。

在脊椎动物的中枢神经系统中，虽然胆碱能突触数量较少，但在成瘾、记忆等过程中发挥关键作用。不过，由于其密度低且与其他神经递质系统相互作用复杂，相关研究存在诸多困难，其分子组织在很大程度上尚不明确。相比之下，果蝇（Drosophila melanogaster）的中枢神经系统以胆碱能为主，nAchR 亚基广泛表达，是研究中枢胆碱能突触分子结构的理想模型。

研究方法

为研究 nAchR 相互作用组，研究人员运用 CRISPR/Cas9 介导的基因组编辑技术，在 nAchR 亚基 Dα1 和 Dα6 的大细胞内环插入生物素连接酶 miniTurbo 进行标记，获得 Dα1^MT和 Dα6^MT果蝇品系。通过免疫染色、共聚焦成像等实验验证 miniTurbo 生物素连接酶活性及标记的准确性，同时利用钙成像和行为学实验评估标记对 nAchR 亚基生理特性的影响。

在蛋白质组学分析方面，收集并匀浆 Dα1^MT/+和 Dα6^MT/+幼虫和成虫的脑组织，经链霉亲和素亲和纯化富集生物素化蛋白，再用胰蛋白酶消化，提取肽段进行 nano - LC - MS/MS 分析。运用 Proteome Discoverer 软件和D. melanogaster UniProt 数据库匹配肽段与蛋白质，并计算其丰度。通过设定富集阈值、进行统计比较和筛选低置信度蛋白，构建 nAchR 相互作用组的蛋白质组图谱。

研究结果

1. nAchR 相互作用组的绘制：免疫染色显示，Dα1^MT和 Dα6^MT的标记信号在幼虫脑叶的神经毡区域很强，且与内源性 HA 标记亚基的染色模式匹配，表明 miniTurbo 标记准确。同时，标记未改变 nAchR 亚基的突触定位和组织分布，在杂合背景下可维持正常胆碱能神经传递，证明 Dα1^MT和 Dα6^MT是研究 nAchR 相互作用组的有效工具。
2. nAchR 相互作用组的组成：通过蛋白质组学分析，构建了包含 537 种蛋白质的 nAchR 相互作用组。基因本体（GO）分析表明，其主要分子功能类别包括 “乙酰胆碱门控阳离子通道活性” 等，细胞组分类别包括 “乙酰胆碱门控通道复合物” 等。相互作用组中还包含多种信号分子、膜蛋白，以及一些非乙酰胆碱受体和与突触前神经递质囊泡释放相关的蛋白。此外，已知的突触后蛋白如 CG1909（果蝇中脊椎动物 nAchR 聚集蛋白 Rapsyn 的同源物）等也在相互作用组中大量存在。
3. nAchR 相互作用组的发育变化：研究发现，近三分之二的鉴定蛋白在至少两组中共享，81 种蛋白组成 “核心” nAchR 相互作用组，可能是构建胆碱能突触的关键分子。Dα1 和 Dα6 在个体发育阶段的相互作用组相似，但也存在亚基特异性蛋白。同时，幼虫和成虫的蛋白质组差异较大，蛋白质组大小增加，共享蛋白的富集值相关性减弱。此外，除 Dα6 外，所有 nAchR 亚基的富集表现出阶段和亚基依赖性变化，从幼虫到成虫阶段，Dα4 和 Dα5 下调，Dα7 上调，提示 nAchR 五聚体组成在发育过程中有重大转变，且这种转变可能与转录调控有关。
4. nAchR 亚基缺失的影响：敲除 Dα1 或 Dα6 后，nAchR 相互作用组组成发生微妙变化。在 Dα1 突变体中，Dα2 和 Dβ2 共缺失，Dα5 和 Dα7 上调；在 Dα6 突变体中，Dα5 共缺失，Dα1、Dα2 和 Dβ2 上调。这种补偿性转变发生在五聚体水平，表明存在两种不同的 nAchR 配置，且亚基缺失后，相关蛋白的变化协调支持新的 nAchR 配置。
5. 候选蛋白的验证：对 nAchR 相互作用组中部分候选蛋白进行转基因 RNAi 敲低实验，通过钙成像和形态学分析评估其功能。结果显示，敲低七种候选基因显著降低幼虫 LNvs 中的钙反应，表明这些蛋白参与调节 nAchR 介导的神经传递。在形态学分析中，除 Sif 外，多数 RNAi 敲低未改变 Drep2::GFP 斑点数量，而 Sif 敲低减少斑点数量，过表达则使斑点增大，说明 Sif 可改变突触后区组织。
6. Sif 的关键作用：Sif 是核心 nAchR 相互作用组中高度富集的蛋白，含有多个蛋白 - 蛋白相互作用结构域。Co - IP 实验证实 Sif 与 nAchR 亚基存在物理相互作用。Sif::GFP 在幼虫脑内与 Dα6 信号大量重叠，Sif 缺失导致突触密度降低、形态改变，nAchR 相互作用组组成显著变化，核心蛋白受影响较大，表明 Sif 在胆碱能突触后位点招募和组织蛋白成分中起核心作用。

研究讨论

本研究利用体内邻近标记技术，在果蝇脑中表征了 nAchR 亚基的局部相互作用组，相比传统方法具有高空间分辨率等优势，揭示了 nAchR 亚型的补偿性转变和多种神经递质受体的存在。果蝇 nAchR 相互作用组包含多种神经递质受体，提示部分中枢突触可能具有与多种神经递质系统相互作用的能力。

从幼虫到成虫阶段，nAchR 相互作用组的扩展反映了突触复杂性的增加，这可能与 PDZ 结构域蛋白的招募有关。同时，nAchR 亚基在发育过程中的转变可能影响受体特性，增强突触灵活性。此外，研究发现中枢胆碱能突触在组织上与其他突触类型相似，但含有独特分子成分，可能依赖不同的 Ca^{2 +}/CaM 依赖性激酶和信号分子调节可塑性，未来对 Rho - GTPase 调节在胆碱能突触可塑性中的研究，可能为认知功能和神经系统疾病的突触机制提供更深入的见解。