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本文聚焦细菌转录过程，研究发现细菌增强子结合蛋白（bEBPs）属于 AAA + 蛋白家族，其通过 ATP 水解驱动 σ54 N 端转运和部分解折叠，重塑转录复合物，揭示了转录起始新机制，为理解细菌基因表达调控提供重要依据。
转录过程概述
转录是 RNA 聚合酶（RNAP）将 DNA 遗传信息转化为 RNA 的多步骤关键过程。在细菌中，σ 因子负责招募 RNAP 至基因启动子区域。多数转录由管家 σ70因子起始，它能自发促使 DNA 解链等，无需转录激活因子参与 。而 σ54是一种特殊 σ 因子，约 60% 的细菌含有它，其主要招募 RNAP 至与营养缺乏、感染及其他应激反应相关基因的启动子区域 。σ54与启动子特定区域结合形成稳定的封闭复合物，无法自发转变为转录起始所需的开放复合物，此时需要细菌增强子结合蛋白（bEBPs）的参与。bEBPs 属于 ATP 酶关联多种细胞活动（AAA+）蛋白家族，以六聚体形式发挥作用，通过 DNA 环化与 RNAP-σ54-DNA 封闭复合物相互作用并重塑该复合物，使其转变为开放复合物，从而启动转录。
研究背景与问题提出
此前研究已揭示 σ54形成稳定封闭启动子复合物抑制转录的机制，以及 bEBP 与 σ54和 DNA 相互作用的部分机制。研究观察到 σ54用 N 端螺旋 “撬开” 启动子 DNA，其 N 端随后被 bEBP 六聚体中央孔捕获。然而，bEBP 六个亚基间 ATP 结合和水解如何促进 σ54和 DNA 构象变化，进而解除 σ54抑制并形成完整转录泡，这一过程仍不清楚。同时，虽然已知 bEBPs 的特征序列基序（GAFTGA）所在环负责包裹 σ54 N 端肽，且不同核苷酸结合状态会影响 bEBP 中 L1 环构象，但核苷酸水解与 σ54 N 端转运的具体偶联机制尚不明确。
实验设计与方法
为探究上述问题，研究人员进行了一系列实验。在蛋白纯化方面，分别对 σ54、PspF1-275（一种 bEBP）、RNAP 核心（α2ββ’ω）进行纯化。如 σ54先经镍亲和层析、肝素亲和层析和凝胶过滤等多步纯化；PspF1-275同样经过镍亲和层析、去除 N 端标签、反向镍亲和层析和凝胶过滤等步骤获得纯品 。RNAP 核心则通过多聚明 P 沉淀、硫酸铵沉淀、离子交换层析等方法纯化。
在复合物制备上，研究人员制备了不同的复合物用于实验分析。如制备 RNAP-σ54复合物，是将 RNAP 与 σ54按一定比例在特定条件下孵育，再经凝胶过滤获得。为研究转录过程中不同阶段的复合物结构，制备了含不同程度预解链 DNA 的复合物，如 RPi (-12/-11)、RPi (-11/-8) 和 RPi (-10/-1) 复合物 。其中，RPi (-12/-11) 复合物使用含 - 12/-11 碱基错配的 DNA 模拟封闭复合物中的 DNA 叉结结构；RPi (-11/-8) 和 RPi (-10/-1) 复合物分别使用部分解链（-11 至 - 8 区域）和完全解链（-10 至 - 1 区域）的 DNA 模拟转录泡形成过程中的中间状态。
在检测分析方法上，运用了多种技术。Native-PAGE 用于分析复合物形成情况，通过该方法可观察不同蛋白与 DNA 结合形成复合物的情况 。冷冻电镜（cryoEM）技术则用于解析复合物的结构，研究人员使用 Titan Krios 显微镜在特定条件下收集数据，并运用 RELION 4.0 等软件进行图像处理，从而获得复合物的高分辨率结构信息。
实验结果
PspF1-275六聚体在 RPi (-12/-11) 中的分析
对 RPi (-12/-11) 复合物的冷冻电镜重构分析显示，可清晰确定 PspF1-275六聚体中每个原聚体的核苷酸状态。原聚体 1 至 4 结合 Mg2+-ADP.AlFx，原聚体 5 为空（apo）状态，原聚体 6 结合 ADP。通过对核苷酸结合口袋关键催化残基的分析发现，原聚体 1 至 4 的 R 手指位置适合 ATP 结合，且仅原聚体 1 的 Walker B 和谷氨酸开关残基处于水解就绪构象，暗示原聚体 1 可能是下一个水解 ATP 的亚基。
从原聚体间相互作用和构象来看，原聚体 1 至 4 间存在广泛相互作用，使得原聚体 2 至 4 的 L1 和 L2 环呈折叠向下构象，原聚体 1 的 GAFTGA 环上保守苯丙氨酸阻止原聚体 2 的 L1 环向上抬起。原聚体 1、5 和 6 在六聚体中约束相对较小。从侧面看，原聚体 1 至 5 形成螺旋，原聚体 1 位于最高点，原聚体 5 位于最低点，原聚体 6 在两者之间。
当原聚体 1 水解 ATP 后，其构象变化会与原聚体 2 产生空间位阻冲突，因此原聚体 1 可能会脱离原聚体 2 并向原聚体 6 移动。这一移动会使原聚体 2 的 L1 环约束解除并伸展，与 σ54 RI 相互作用，同时使原聚体 2 的核苷酸结合口袋转变为水解就绪状态。原聚体 1 与原聚体 6 结合后，会促进原聚体 6 释放核苷酸变为 apo 状态，进而引起原聚体 6 和原聚体 5 的构象变化，使原聚体 5 能够结合 ATP，完成六聚体内核苷酸状态的亚基间转换。
原聚体 1 水解 ATP 时，L1 环向下折叠，拉动 σ54 N 端肽段，其余原聚体与 σ54 N 端肽段的保守疏水残基形成疏水 “滑动” 相互作用，促进肽段滑动。σ54 N 端的转运导致 RI-H1 解折叠，破坏其与 ELH 的疏水相互作用，从而解除对转录起始的抑制。此外，L1 环构象变化及 RI 转运均会改变与 DNA 的相互作用，这些变化可能共同促进 PspF 水解 ATP 诱导的 DNA 解链。
RPi (-11/-8) 和 RPi (-10/-1) 复合物的结构
研究人员使用含不同程度预解链 DNA 的底物制备 RPi (-11/-8) 和 RPi (-10/-1) 复合物，以研究 ATP 水解对启动子 DNA 的影响。实验发现，部分底物可支持转录，而 - 11 至 - 8 区域部分解链的 DNA 不能支持转录，表明该复合物无法进一步转变为开放复合物。
对 RPi (-11/-8) 复合物结构分析显示，其存在多种结构构象，PspF1-275六聚体环相对于 RNAP-σ54有不同程度倾斜，RNAP 夹钳开口程度不同，启动子 DNA 有明显弯曲，-10 下游 DNA 密度分辨率差，表明该区域高度灵活。其中一种高分辨率构象显示，PspF 六聚体环相对于 RPi (-12/-11) 倾斜约 50°，DNA 弯曲约 45°。
RPi (-10/-1) 复合物也存在多种 PspF1-275六聚体环构象，一种高分辨率构象下，六聚体环倾斜约 50°，与 RPi (-11/-8) 相似，但 DNA 弯曲更严重，超过 70°。在这两种复合物中，与 DNA 相互作用的原聚体均位于六聚体环的最高位置，且发现了 PspF 与 σ54 RpoN 结构域之间一种此前未报道的相互作用，该相互作用仅在六聚体环倾斜构象下存在，有助于稳定这种环构象，从而获得更高分辨率的重构结果。
对比 RPi (-11/-8) 和 RPi (-10/-1) 复合物中 PspF1-275六聚体原聚体的相对位置发现，RPi (-10/-1) 中 “动力冲程” 原聚体（原聚体 1）相对于 RPi (-11/-8) 发生了明显位移，向原聚体 6 靠近，L1 环间距离从 27 ? 缩短至 4 ?，这与提出的原聚体 1 水解 ATP 后在六聚体螺旋中向下移动的模型相符。综合 RPi (-12/-11)、RPi (-11/-8) 和 RPi (-10/-1) 复合物的结果，捕获到的三种构象状态与 ATP 水解循环中原聚体重定位模型一致。此外，在这些复合物中，σ54 N 端在 PspF 六聚体中的位置进一步移动，同时 RI-H1 的密度质量降低，表明 RI N 端转运导致 RI-H1 解折叠，逐渐解除对 σ54 ELH 的约束。
讨论
研究结果有力支持了 bEBPs 利用 ATP 水解驱动 σ54 N 端穿过新生转录泡进入 AAA + 结构域六聚体孔的分子机制。ATP 水解产生两个重要后果：一是 σ54 N 端进一步转运进入六聚体孔，导致 RI-H1 螺旋解折叠，破坏其与 ELH 的相互作用，解除对转录起始的抑制。只需解折叠约 26 个残基的 RI-H1，而非整个肽链，就足以重新定位 ELH 并解除抑制；二是 PspF1-275六聚体环倾斜，这种倾斜改变了 PspF 与 DNA 的相互作用，有助于或稳定 DNA 解链，同时直接影响 DNA 构象，使 DNA 弯曲，进一步促进 DNA 解链并加载到 RNAP 活性位点。
研究中 PspF1-275在 RPi 复合物中的结构表明，ATP 结合发生在六聚体螺旋底部的原聚体上，原聚体按逆时针方向逐渐处于水解就绪状态，位于螺旋顶部的原聚体 1 通过水解 ATP 执行 “动力冲程”，转运 σ54 N 端，随后转变为原聚体 6 的构象，原聚体 2 成为下一个 “动力冲程” 亚基。这与一些 AAA + 蛋白的顺序模型不同，那些蛋白利用孔环与底物相互作用，而 PspF 则利用 L1 环与底物结合，其等效孔环缺乏保守的 KW/Y 基序且离底物较远。该研究提出的 bEBPs 模型与 ClpX 的模型更为一致，即顶部原聚体水解 ATP 后向螺旋底部移动并转运底物。但与其他 AAA + 转运酶不同，bEBPs 并非连续转运肽段来解折叠蛋白质或结构域，而是部分解折叠以重塑转录复合物，目前尚不清楚 bEBPs 进行核苷酸水解的具体数量及水解和蛋白质解折叠的调控机制。在论文修订期间，Darst 实验室的预印本报道了与该研究中 RI-H1 螺旋解折叠相关的结构和结论，与本研究结果一致。
