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青蒿素（ART）是重要抗疟药，其现有生产方式受限。研究人员开展了双氢青蒿酸脱氢酶（AaDHAADH）介导的青蒿素生物合成替代途径研究。结果发现 AaDHAADH 可催化双氢青蒿酸（DHAA）与青蒿酸（AA）相互转化，优化突变体可提高 DHAA 产量，为 ART 合成提供新路径。
在疟疾防治的战场上，青蒿素（ART）无疑是一员 “猛将”。自 20 世纪 70 年代从传统中药黄花蒿（Artemisia annua L）中被分离出来，它就成为了治疗疟疾的关键药物，尤其是对耐甲氟喹的恶性疟原虫，有着显著的杀灭效果，至今仍是世界卫生组织推荐的青蒿素联合疗法（ACTs）中的一线抗疟药。而且，随着研究的深入，人们发现青蒿素及其衍生物还具备多种其他生物活性，比如抗肿瘤、免疫调节、抗炎、抗病毒，甚至能用于治疗多囊卵巢综合征等，这使得对青蒿素的需求与日俱增。
然而，青蒿素的获取面临着重重困难。目前，它主要从植物中直接提取，但在黄花蒿中的含量仅占干重的 0.1 - 1.0%，产量低严重限制了其在高需求市场的应用。虽然合成生物学的发展让一些原本只能在特定物种中合成的天然活性化合物，如青蒿酸（AA），可以在微生物或异源植物中生产，但至今仍没有基因工程菌能够直接生产青蒿素，异源植物合成青蒿素的含量也极低。究其原因，青蒿素生物合成的终端途径，尤其是酶催化步骤尚不明确，这就像在黑暗中摸索前行，找不到准确的方向。
为了突破这些困境，暨南大学的研究人员踏上了探索之路。他们开展了双氢青蒿酸脱氢酶（AaDHAADH）介导的青蒿素生物合成替代途径的研究。研究发现，AaDHAADH 能够催化 AA 和双氢青蒿酸（DHAA）之间的双向转化，通过定点突变获得的优化突变体 AaDHAADH（P26L）对 AA 的催化活性是原始基因的 2.82 倍。利用该优化基因，在酿酒酵母（S. cerevisiae）中实现了 DHAA 的从头合成，在 5L 生物反应器中发酵工程酿酒酵母，可获得 3.97g/L 的 DHAA。这一发现为青蒿素的生物合成提供了一条更便捷、高效的替代途径，大大提升了青蒿素半合成生产的潜力，有望缓解青蒿素供应不足的问题，为全球疟疾防治和相关疾病治疗带来新的希望。该研究成果发表在《Nature Communications》上。
研究人员在此次研究中运用了多种关键技术方法。在筛选和鉴定相关酶时，采用了传统的酶学方法，结合蛋白质组学和生物信息学技术，从黄花蒿叶片粗酶中逐步分离、筛选出目标酶。为了深入了解酶的特性和催化机制，运用了定点突变技术对 AaDHAADH 进行改造，同时通过酶动力学分析测定相关参数。在验证酶的功能和生产 DHAA 的过程中，构建了多种转基因细胞系和工程菌株，包括在黄花蒿细胞中进行过表达（OE）和 RNA 干扰（RNAi）实验，以及在酿酒酵母和本氏烟草（N. benthamiana）中进行相关基因的整合和表达实验 。
下面详细介绍研究结果：
- AaDHAADH 的分子克隆与功能表征：研究人员首先利用传统酶学方法筛选候选基因。他们发现黄花蒿叶片粗酶能催化 AA 和 DHAA 之间的转化，推测其中可能含有相关氧化还原酶。经过一系列复杂的分离纯化步骤，包括 80% 硫酸铵沉淀、葡聚糖 G50 和 G25 凝胶柱层析以及 DEAE 层析，得到了活性组分 DEAE - 2。通过质谱分析和生物信息学筛选，确定了一种名为 AaDHAADH 的活性酶，它能够在大肠杆菌（E. coli）和本氏烟草中催化 AA 和 DHAA 的双向转化，而其他候选酶则无此活性。
- AaDHAADH 的酶学特性：研究人员对 AaDHAADH 的表达条件和酶学特性进行了深入研究。发现诱导 AaDHAADH 表达的最佳 IPTG 浓度为 0.6mM，其最佳反应 pH 为 7.5，最佳反应温度为 30°C。催化 AA 生成 DHAA 的最佳反应时间为 4h，催化 DHAA 生成 AA 的最佳反应时间为 6h。酶动力学分析表明，AaDHAADH 对 AA 的亲和力更强，更倾向于催化 AA 转化为 DHAA。此外，通过亚细胞定位实验发现，AaDHAADH 主要定位于细胞质和细胞核，与 DBR2 在亚细胞定位上存在差异，这可能影响它们的底物特异性。
- AaDHAADH 的催化机制与定向改造：借助分子对接技术，研究人员发现 AA 与 AaDHAADH 活性口袋中的 P26 等氨基酸残基相互作用，而 DHAA 则不与 P26 相互作用。通过定点突变实验验证，P26 是决定 AaDHAADH 催化活性的关键氨基酸残基。在此基础上，研究人员对 AaDHAADH 进行了定点突变，获得了 11 种突变体，其中 AaDHAADH（P26L）对 AA 的催化活性最高，是原始菌株的 2.82 倍，且其对 AA 的结合亲和力也有所提高。
- AaDHAADH 在黄花蒿细胞中的功能分析：为了进一步验证 AaDHAADH 在黄花蒿中的功能，研究人员构建了过表达和 RNA 干扰的转基因黄花蒿细胞系。通过 qRT - PCR 分析筛选出表达量有显著变化的细胞系，测定其中 AA、DHAA 和 ART 的含量。结果发现，过表达 AaDHAADH 的细胞系中，DHAA 和 ART 含量增加，AA 含量减少；RNA 干扰的细胞系中则相反。这直接证明了 AaDHAADH 在青蒿素生物合成中的重要作用，确认了 DHAA 是青蒿素生物合成的关键中间产物。
- 在酿酒酵母中从头合成 DHAA：为实现 DHAA 的大规模生产，研究人员对酿酒酵母进行了代谢工程改造。通过基因组整合的方法，增强酿酒酵母内源性甲羟戊酸（MVA）途径中关键基因的表达，提高了法呢基焦磷酸（FPP）的产量。在此基础上，逐步整合参与 AA 生物合成的基因，构建出能够生产 AA 的菌株。最后，将优化后的 AaDHAADH（P26L）整合到基因组中，成功获得了生产 DHAA 的酿酒酵母菌株。在 5L 生物反应器中进行发酵，DHAA 产量可达 3.96g/L，相比摇瓶发酵有了大幅提升。
- 在本氏烟草中重构青蒿素生物合成：由于 DHAA 可自动氧化生成 ART，研究人员在本氏烟草中设计了 ART 生产系统。通过在本氏烟草中瞬时表达多种已知功能的蛋白质和优化后的 AaDHAADH（P26L），成功实现了 AA 和 DHAA 的生产。虽然最初未检测到 ART，但经过紫外线照射加速 DHAA 的自动氧化后，检测到了少量 ART。
研究结论和讨论部分指出，研究人员成功鉴定出了催化 AA 转化为 DHAA 的活性酶 AaDHAADH，并对其功能和催化机制进行了深入研究。通过定点突变优化了 AaDHAADH 的催化活性，实现了在酿酒酵母中高效生产 DHAA，为青蒿素的半合成生产提供了一条更优的途径。尽管目前在合成生物学生产青蒿素方面仍面临终端生物合成途径不明确等挑战，但该研究成果具有重要的理论和实践意义。它不仅加深了人们对青蒿素生物合成途径的理解，也为未来进一步优化青蒿素生产、探索新的合成方法奠定了坚实基础，有望推动疟疾防治和相关药物研发领域取得更大的进展。
