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在生物学研究中，细胞表型变化对揭示细胞功能扰动意义重大。为解决传统细胞绘画（Cell Painting，CP）技术局限，研究人员开展 Cell Painting PLUS（CPP）技术研究。结果显示，CPP 扩展了 CP 的多重检测能力等。这为深入研究细胞机制提供新方法。
在生命科学研究的微观世界里，细胞就像一个个神秘的小宇宙，它们的形态和内部组织变化蕴含着许多关于生命活动的秘密。细胞表型的改变往往暗示着细胞功能出现了扰动，这一现象在基础研究、药物研发以及监管毒理学等领域都备受关注。传统的基于成像的高通量表型分析（HTPP）方法，如细胞绘画（Cell Painting，CP）技术，在研究细胞表型方面发挥了重要作用。它通过用荧光染料对细胞进行染色，再借助高内涵成像技术获取多维图像数据集，进而提取细胞形态特征信息，为研究化合物或基因扰动对细胞的影响提供了有力手段。
然而，CP 技术并非完美无缺。在大规模高通量筛选项目中，CP 技术倾向于在亚融合条件下研究少数几种细胞类型，这虽然有利于空间成像，但却限制了表型分析数据集的生理相关性和机制多样性，许多细胞类型特异性的反应被忽视。而且，CP 技术为了兼顾成本和时间效率，通常使用固定的染料组合，在四到五个成像通道中获取数据，这使得一些染料信号不得不合并在同一通道，如 RNA + ER 和 / 或 Actin + Golgi，从而牺牲了表型谱的细胞器特异性。
为了突破这些局限，来自德国联邦风险评估研究所（German Federal Institute for Risk Assessment，BfR）等机构的研究人员展开了一项极具创新性的研究。他们开发了一种名为 Cell Painting PLUS（CPP）的检测方法，为细胞表型分析领域带来了新的曙光。该研究成果发表在《Nature Communications》上，引起了广泛关注。
研究人员在研究过程中运用了多种关键技术方法。首先是细胞培养技术，他们选用了 MCF - 7/vBOS、U2OS、HepG2 和 RPTEC - TERT1 等多种细胞系，并对其进行常规培养，确保细胞处于良好的生长状态。其次是成像技术，利用 Opera Phenix 高内涵筛选系统，在共聚焦模式下对细胞进行成像，获取高质量的图像数据。此外，还运用了图像分析和数据处理技术，借助 Harmony 和 Cell Profiler 等软件对图像进行分析，提取细胞特征，并通过 KNIME 软件进行数据标准化、生成化合物活性谱等操作，同时运用基准浓度（BMC）建模等方法对数据进行深入分析。
CPP 扩展了 CP 方法的多重检测能力
研究人员以激素反应性的 MCF - 7/vBOS 乳腺癌细胞系为研究对象，对传统 CP 方法进行优化，开发出 CPP 检测方法。在对比研究中，传统 CP 方法使用四个激光线，将光谱范围重叠的染料（RNA/ER 和 Actin/Golgi）在同一成像通道捕获，而 CPP 方法则将所有染料在单独的成像通道中捕获，这样能为细胞器提供更具体的信息，并且还增加了对溶酶体的染色。在选择和评估适合 CPP 的染料时，研究人员系统地研究了染料的光谱串扰（发射渗漏和交叉激发）以及信号随时间的稳定性。结果发现 RNA 染料存在发射渗漏和交叉激发现象，不过通过在 CPP 检测中依次对每个染料进行成像，可避免发射渗漏对染色特异性的影响。此外，所有 CPP 染料在染色后 4 周内均可检测到，但染色强度仅在第 1 天内保持足够稳定，因此成像需在染色后 24 小时内进行。而且，CPP 与传统 CP 方法使用的染料浓度相似，筛查成本相近，额外试剂成本主要源于溶酶体染料。
CPP 能够使用高效的染料洗脱缓冲液进行迭代染色 - 洗脱循环
为实现细胞的迭代染色，研究人员开发了一种染料洗脱缓冲液。该缓冲液能有效去除染色信号，同时保留亚细胞区室和细胞器的形态。通过对多种缓冲液成分和参数进行广泛测试，确定了每种染料的最佳洗脱缓冲液组成。研究发现，最终的 CPP 洗脱缓冲液（0.5 M L - 甘氨酸，1% SDS，pH 2.5）在洗脱除线粒体染料外的所有染料信号方面表现出色，相比其他已发表的用于抗体洗脱的缓冲液更高效，且在时间和成本上也更具优势。研究人员还探究了洗脱步骤对细胞的影响，发现除肌动蛋白（Actin）染料外，其他染料在洗脱后可重新染色，且细胞器形态得以保留。在最终的 CPP 染色 - 洗脱工作流程中，将两种活细胞染料（溶酶体和线粒体染料）以及 Actin 染料和 RNA 染料放在染色循环 1 中，DNA、高尔基体（Golgi）和内质网（ER）染料则放在染色循环 2 中。此外，研究人员还在 U2OS、HepG2 和 RPTEC 等多种细胞系中测试了该方法，结果表明，CPP 无需对染色方案或图像 / 数据分析流程进行进一步修改，即可适用于不同细胞系，展示了其广泛的适用性。
使用 CPP 对化合物效应进行编码扩展了表型谱的多样性
为比较 CPP 与传统 CP 方法，研究人员建立了包含 13 种不同化合物（药物、生物毒素、植物生物碱和工业化学品）以及 2 种阴性对照化合物和 DMSO 溶剂对照的参考化合物板。在 MCF - 7、HepG2、U2OS 和 RPTEC 细胞中进行小规模 CPP 筛选，并在 MCF - 7 细胞中同时进行 CP 筛选。通过定制的图像和数据分析工作流程对数据进行分析，结果显示，CPP 参考化合物筛选的化合物活性谱在四种细胞系中呈现出明显的浓度依赖性活性模式。例如，氟奋乃静、西拉菌素和粉防己碱在非细胞毒性浓度下对溶酶体通道有显著影响；细胞松弛素 D 在 Actin 通道、氯化小檗碱在 Mito 通道的活性突出。而且，CPP 和 CP 在 DNA 和 Mito 通道的化合物活性谱基本一致，但 CPP 能够更精确地将 RNA/ER 和 AGP 通道中的反应分配到特定细胞器通道，这表明 CPP 扩展了表型谱的多样性。
CPP 是一种稳健的检测方法，可生成可重复的表型谱
为评估 CPP 检测方法的稳健性，研究人员分析了 CPP 参考化合物筛选中三个板内 / 技术重复（TRep）和四个板间 / 生物学重复（BRep）的稳健 z 分数的可重复性。结果发现，所有细胞系在 CPP 检测中，20x 或 40x 放大倍数下的皮尔逊相关系数得分都很高，与 MCF - 7 细胞中使用 CP 方法得到的得分相似。在 MCF - 7 细胞中，CPP 检测的总变异性比 CP 方法更小。此外，研究还表明，特征数据的变异系数主要取决于成像的细胞数量，而非成像视野数量，捕获约 2500 个细胞即可确保数据的统计稳健性。因此，在 CPP 检测中，采用单技术但至少四个生物学重复，并使用 20x 放大倍数，可确保其稳健性、可重复性和在 HTPP 平台上的适用性。
BMC 建模能够研究浓度依赖性的表型反应
研究人员使用基准浓度（BMC）建模方法，确定参考化合物引发表型反应的具体浓度。通过对每个特征的 BMC 进行计算，发现 CPP 和 CP 在 MCF - 7 细胞中得到的 BMC 值的皮尔逊相关系数得分非常相似，但所有细胞系的 BMC 值的皮尔逊相关系数得分普遍低于稳健 z 分数，这表明 BMC 曲线拟合在一定程度上增加了数据变异性。研究人员进一步将特征分配到具有生物学意义的特征类别中，通过可视化每个特征类别中显示显著反应的特征比例（Proportion BMC 谱），发现不同化合物在不同细胞系和特征类别中的活性存在差异。例如，鱼藤酮在所有特征类别和细胞系中都有广泛活性；细胞周期抑制剂依托泊苷仅在增殖的癌细胞系（HepG2、U2OS 和 MCF - 7）中有活性，而在分化的 RPTEC 细胞中无活性；氟维司群仅在 MCF - 7 细胞中引发表型反应，反映了其作为雌激素受体 α 信号通路特异性抑制剂的功能。此外，通过分析 BMC 积累图和幅度图，可区分化合物在低浓度（可能是主要效应）和高浓度（可能是次要效应）下的作用，这表明 BMC 建模有助于更深入地了解化合物的作用机制。
研究人员通过三个具体案例进一步展示了 CPP 检测方法的优势。在研究核仁相关变化时，将核仁纳入 CPP 和 CP 的图像和数据分析流程，发现雷帕霉素等化合物可对核仁数量和形态产生显著影响，这为研究核糖体生物发生和核仁应激反应机制提供了重要信息。在区分 Actin 和 Golgi 对化合物的反应时，由于 CPP 将 Actin 和 Golgi 信号在单独通道捕获，可观察到细胞松弛素 D 和拉春库林 B 处理细胞后，Actin 和 Golgi 的反应在浓度和程度上存在差异，且 BMC 建模有助于区分这些差异，突出了 CPP 在比较化合物作用机制方面的优势。在研究化合物对溶酶体的影响时，将溶酶体纳入 CPP 检测，发现西拉菌素、氟奋乃静和粉防己碱等化合物可诱导溶酶体表型变化，且 CPP 能够区分 ER 和 RNA 或 Actin 和 Golgi 的效应，为深入了解化合物的作用机制提供了有价值的见解。
综上所述，CPP 检测方法在细胞表型分析领域具有重要意义。它在传统 CP 方法的基础上进行创新，通过迭代染色 - 洗脱循环，实现了用至少七种荧光染料对至少九个不同亚细胞区室和细胞器进行标记，大大扩展了检测的灵活性、可定制性和多重检测能力，提高了表型谱的细胞器特异性和多样性。尽管 CPP 在成本、时间和资源上比 CP 有更高的投入，且存在一定局限性，但在研究更复杂的细胞模型时，其优势更加明显。未来，CPP 有望应用于更大规模的化合物库筛选，为毒理学和药物研发提供更全面、更具机制特异性的形态学谱，推动相关领域的发展，为人类健康研究做出更大贡献。
