靶向小眼畸形相关转录因子（MITF）抑制剂 ML329 治疗胃肠道间质瘤的临床前新突破

胃肠道间质瘤（GISTs）是常见的胃肠道肉瘤，伊马替尼治疗易产生耐药性。本文研究发现，MITF 通路抑制剂 ML329 可抑制 GIST 细胞生长，诱导细胞周期停滞，体内实验也证实其能显著抑制肿瘤生长，为治疗耐药性 GIST 提供新方向。

　　

引言

胃肠道间质瘤（GISTs）是胃肠道中最常见的肉瘤，约占胃肠道间质肿瘤的 80%。它起源于胃肠道的 Cajal 间质细胞（ICC），这些细胞原本负责调节胃肠道的运动。GISTs 的发生主要源于 KIT 或 PDGFRA 基因的激活突变，这两种突变相互排斥 。

酪氨酸激酶抑制剂（TKIs），尤其是一线药物伊马替尼，针对 KIT 和 PDGFRA 靶点，显著改善了 GIST 患者的生存状况，特别是对于转移性 GIST 患者。然而，由于 KIT 或 PDGFRA 基因的额外突变，导致肿瘤细胞产生耐药性，出现了多种耐药肿瘤细胞克隆，这使得伊马替尼等 TKIs 的治疗效果大打折扣。因此，迫切需要深入了解耐药机制，并探索新的治疗方法。

小眼畸形相关转录因子（MITF）属于基本螺旋 - 环 - 螺旋亮氨酸拉链（bHLH - ZIP）家族，是 MiT 家族的成员之一（该家族还包括 TFEB、TFEC 和 TFE3），在肥大细胞和黑素细胞的分化过程中发挥着重要作用。在黑素细胞和黑色素瘤细胞中，MITF 直接调控黑色素生成酶的转录，以及抗凋亡蛋白 BCL2 和细胞周期调节蛋白 CDK2 等基因的表达，这些基因对细胞的生存至关重要。此外，MITF 与 KIT 之间存在相互调节关系，在黑素细胞中，MITF 影响 KIT 的表达；而在肥大细胞增多症（一种由 KIT 激活突变，最常见为 KIT D816V 突变引起的罕见疾病）中，KIT 信号传导又能增强 MITF 的表达，导致肥大细胞过度增殖和在组织中积累。

前期研究发现，MITF 在 GIST 中表达，并且沉默 MITF 对 GIST 细胞在体外和体内的生长都至关重要。基于此，本研究进一步探究使用特异性 MITF 抑制剂 ML329 靶向 MITF 分子通路的有效性。

结果

1. ML329 降低 GIST 细胞系的细胞活力
   研究选取了伊马替尼敏感的 GIST - T1 细胞系和伊马替尼耐药的 GIST 430/654 细胞系（该细胞系携带外显子 13 的 KIT 突变（Val654Ala），与 GIST 对伊马替尼的耐药性相关），用不同剂量（0.3 - 10 μM）的 ML329 处理细胞。结果显示，处理 3 天后，GIST - T1 和 GIST 430/654 细胞的活力和增殖能力均显著降低，其中 GIST - T1 细胞更为敏感。通过细胞活力测定计算得出，GIST - T1 细胞在第 3 天的 IC₅₀为 0.76 ± 0.10 μM，GIST 430/654 细胞在第 10 天的 IC₅₀为 2.7 ± 0.6 μM。

报告基因分析表明，ML329 显著抑制了 GIST 细胞中 MITF 的活性。同时，细胞活力和增殖的下降伴随着两种细胞系中半胱天冬酶（caspase）活性的显著增加。研究还发现，铁螯合剂甲磺酸去铁胺可显著逆转 ML329 对细胞存活的影响，而坏死磺酰胺则不能，这表明用 ML329 处理的细胞对铁死亡（ferroptosis）的敏感性增加。

此外，研究人员分析了 ML329 与 TKI 抑制剂联合使用的效果。结果显示，在 GIST - T1 细胞中，ML329 与伊马替尼联合使用未表现出明显的协同或相加效应；在伊马替尼耐药的 GIST430/654 细胞中，ML329 与新一代 TKI 抑制剂瑞普替尼联合使用时，观察到了较弱的协同效应，所有协同评分均为正值，且 HSA 值具有统计学意义。
2. ML329 处理降低 MITF 及其依赖靶点的表达
ML329 处理对伊马替尼敏感的 GIST - T1 细胞系，在较低剂量和较短暴露时间下，降低细胞活力的效果更为显著；相比之下，伊马替尼耐药的 GIST 430/654 细胞系则需要更高剂量或更长时间的处理。进一步实验发现，用 5 μM 的 ML329 处理 GIST - T1 细胞 3 天，可持续降低 MITF、KIT、BCL2 和 CDK2 的表达；类似地，处理 GIST 430/654 细胞 10 天后也观察到相同结果。由于 CDK2 的减少，研究人员进一步研究了细胞周期，发现 ML329 使 GIST - T1 细胞停滞在 S 期，而 GIST430/654 细胞停滞在 G2/M 期。
3. ML329 抑制伊马替尼敏感和耐药的 GIST 异种移植瘤的生长
研究人员在 NMRI - nu/nu 小鼠中构建了伊马替尼敏感或耐药的 GIST 细胞系异种移植瘤模型。当肿瘤体积达到中位数 200 mm³时，开始对小鼠口服给予先前确定的有效剂量的 ML329。在整个实验过程中，通过定期测量小鼠体重评估药物诱导的毒性。当肿瘤体积超过 1200 mm³时，对小鼠实施安乐死。

结果显示，与对照组相比，接受 ML329 处理的小鼠在所有情况下肿瘤均显著缩小，且生存百分比增加。对每种移植瘤的六个肿瘤组织进行检测，发现 ML329 处理后 MITF 表达降低。

讨论

GIST 的致癌驱动因素主要是 KIT 和 PDGFRA 基因的一系列原发性功能获得性突变。伊马替尼作为初始治疗药物，通过结合 KIT 或 PDGFRA 并阻止其酪氨酸激酶活性发挥作用。然而，KIT 基因的继发性和异质性等位基因突变会导致药物结合丧失，产生耐药性，这是伊马替尼耐药的主要机制。在一线伊马替尼治疗失败后，GIST 患者会依次接受舒尼替尼、瑞戈非尼、阿伐替尼（仅适用于 PDGFRA Asp 842 Val 突变的 GIST）和瑞普替尼等 TKI 治疗，但这些抑制剂很少能使患者完全缓解，最终仍会出现耐药。

本研究表明，MITF 通路抑制剂 ML329 可降低伊马替尼敏感和耐药的 GIST 细胞系中 MITF 的表达及其依赖靶点的表达。处理后，BCL2 和 CDK2 表达下调，细胞活力和增殖率降低。研究使用的伊马替尼耐药模型 GIST - 430/654 携带外显子 13 Val 654 Ala 突变，此外，外显子 13 和 17 的突变均与伊马替尼耐药相关。研究还评估了携带外显子 11（Val 560 Asp）和外显子 17（Asp 820 Ala）突变的 GIST 48 细胞系，发现其细胞活力也有所下降，与 GIST 430/654 相似。伊马替尼耐药的 GIST 48 和 GIST 430/654 细胞增殖速度比伊马替尼敏感的 GIST - T1 细胞慢，这可能是它们对 MITF 抑制敏感性存在差异的原因。

CDK2 参与调节 G1/S 和 G2/M 期的转换，ML329 处理后，伊马替尼敏感和耐药的 GIST 细胞系出现不同的细胞周期动态变化和停滞，这可能源于 CDK2 水平或细胞生长速率的差异。同时，ML329 处理后 KIT 表达降低，可能也是细胞死亡率增加的原因之一。此前研究表明，沉默 MITF 可降低 KIT 蛋白表达并增加细胞凋亡，虽然未发表的转录组数据显示 MITF 缺失的 GIST 细胞中 KIT 表达的降低无统计学意义，但 KIT 蛋白水平显著降低，这表明在 GIST 中 KIT 表达可能涉及额外的翻译后或间接调节机制。

ML329 在伊马替尼敏感和耐药的 GIST 细胞模型中，均可诱导半胱天冬酶活性适度但显著增加。研究还发现，添加甲磺酸去铁胺（铁死亡抑制剂）后，细胞死亡明显得到挽救，这表明 ML329 会导致铁积累和活性氧（ROS）生成。在黑色素瘤细胞中，MITF 在调节铁死亡方面发挥作用，主要作为保护因子，通过调节与脂质稳态和抗氧化反应相关的基因来实现。因此，推测 MITF 的减少可能会增加细胞对铁死亡的敏感性，但这在 GIST 中的相关性还需进一步研究。

ML329 与 TKI 抑制剂联合使用，在伊马替尼敏感的 GIST 细胞中未显示出优势，但在伊马替尼耐药的 GIST 治疗中可能具有一定潜力。此外，本研究还表明，使用 ML329 抑制 MITF，对已建立的肿瘤具有抑制作用，可提高小鼠的生存率。

除了 GIST 和黑色素瘤，MITF 还与胰腺癌、肝细胞癌和乳腺癌等其他肿瘤的发生过程相关。例如，在 HER2 阴性、对 CDK4/6 抑制剂耐药的晚期或转移性乳腺癌中，ML329 可有效恢复对帕博西尼（一种 CDK4/6 抑制剂）的敏感性。在某些肉瘤，如透明细胞肉瘤（CCS）中，MITF 被认为是致癌因素，敲低 MITF 可损害 CCS 细胞的生存和增殖；在肾癌细胞中，敲低 MITF 可抑制细胞增殖，并使细胞停滞在 S/G2 期，抑制体内肿瘤形成。

本研究证实 ML329 作为 MITF 通路抑制剂，在体外和体内均能有效降低伊马替尼敏感和耐药的 GIST 细胞的存活率，且耐受性良好，有望成为治疗伊马替尼耐药的 GIST 的潜在治疗选择。未来研究应进一步阐明 ML329 对 MITF 及其下游靶点的抑制作用的分子机制，探索 ML329 与其他靶向疗法（如 TKI 抑制剂或 CDK4/6 抑制剂）联合使用的效果，评估其在更广泛的 GIST 模型（包括罕见亚型）中的疗效，以及在体内的长期安全性。

材料和方法

1. 抗体和试剂：实验中使用的多种抗体，如小鼠抗 C - KIT（E1）、小鼠抗 BCL2、小鼠抗 CDK2 等分别购自不同公司。ML329 购自 Axon Med Chem，其他试剂也均有明确的来源。
2. 细胞培养：人 GIST 细胞系由 Dr. S. Bauer 提供。伊马替尼敏感的 GIST - T1 细胞、伊马替尼耐药的 GIST 430/654 细胞和 GIST 48 细胞分别在特定的培养基中培养，并添加相应的成分，同时定期对所有细胞系进行支原体检测。
3. 细胞活力、增殖、荧光素酶测定和半胱天冬酶活性检测：将 GIST - T1 和 GIST 430/654 细胞接种在 96 孔板中，使用结晶紫法和基于 WST - 1 的比色法分别在不同时间点测量细胞存活和增殖情况。按照制造商的方案，使用 Caspase - Glo 3/7 检测试剂盒测量半胱天冬酶活性，利用 TRPM - 1 报告基因检测 MITF 活性。
4. 蛋白质免疫印迹（Western blot）：用不同浓度的 ML329 或 DMSO 处理细胞后，测定蛋白质浓度，进行电泳和电转膜，然后使用指定抗体进行蛋白质免疫印迹，通过增强化学发光法可视化蛋白质。
5. 流式细胞术分析细胞周期：处理后的 GIST 细胞经洗涤、胰酶消化、固定后，用碘化丙啶染色，使用 FACSCalibur 获取数据，并用 FlowJo 7.6 软件进行分析。
6. 体内异种移植瘤实验：在 NMRI - nu/nu 小鼠中皮下注射 GIST - T1 或 GIST430/654 细胞，构建异种移植瘤模型。当肿瘤体积达到一定标准时，开始随机分组和治疗，所有实验操作均遵循相关指南和规定。
7. 确定 ML329 的有效给药剂量：将小鼠分为不同治疗组，监测肿瘤体积和体重，当肿瘤体积达到 1200 mm³时，对小鼠实施安乐死。
8. ML329 的体内抗肿瘤活性研究：小鼠分为对照组和 ML329 治疗组，定期评估肿瘤体积和体重，在规定时间或肿瘤体积达到标准时，对小鼠实施安乐死。
9. 统计数据分析：使用 GraphPad Prism 9 软件评估 IC₅₀，进行统计分析。采用未配对 Student's t 检验评估两组实验之间的显著差异，用单因素方差分析（ANOVA）检验多组之间的显著差异。使用 SynergyFinder 评估协同作用，用 Log rank（Mantel - Cox）和 Gehan - Breslow - Wilcoxon 检验进行体内实验的生存分析。

数据可用性

本研究中使用和分析的数据集，可在合理请求下从相应作者处获得。

致谢

研究得到了相关机构的技术支持，并获得了多项资金资助，包括西班牙科学、创新和大学部（MICIU）、欧洲区域发展基金（ERDF）、西班牙抗癌协会（AECC）等的资助。

作者贡献

实验工作由 M.G.、E.P. - P.、A.G. - V.、B.R. - C. 和 J.R. 完成，他们也参与了论文的审阅。实验由 E.S. - C.、C.S. 和 M.M. 构思，他们提供了资金支持，并参与了论文的撰写和审阅。

利益冲突声明

C.S. 从多家公司获得研究资助、咨询费、讲课费和旅行资助，存在潜在利益冲突。

补充信息

文章提供了补充信息文档，包括相关图示和完整文章内容等。