基因编辑与多策略解析：烟草 NtSPS1 敲除对萜类物质及抗烟草花叶病毒（TMV）活性的影响

为探究 NtSPS1 敲除对烟草萜类物质含量及抗 TMV 活性的影响，研究人员运用基因编辑、代谢组学、网络药理学等技术展开研究。结果发现 48 种萜类物质变化，化合物 36 有潜在抗 TMV 活性。这为烟草抗 TMV 研究提供新方向。

　　在烟草的世界里，隐藏着许多有趣的秘密等待人们去探索。烟草花叶病毒（TMV）就像一个不速之客，它的宿主范围广泛，常常在烟草、番茄、辣椒等植物间肆意 “捣乱”，给农业生产带来不小的损失。而植物自身含有的一些代谢产物，尤其是萜类物质，被发现似乎具有对抗 TMV 的能力。其中，NtSPS1 作为烟草中一个关键的结构基因，它在调控萜类物质含量方面扮演着重要角色。然而，NtSPS1 基因缺失后，烟草中萜类物质的具体变化情况以及对烟草抗 TMV 活性的影响，此前还没有人进行过系统研究。为了揭开这些谜团，来自中国烟草云南工业有限责任公司云南省烟草化学重点实验室、云南民族大学民族药资源化学国家民委 - 教育部重点实验室以及中国农业科学院烟草研究所的研究人员，踏上了探索之旅。

研究人员运用基因编辑（CRISPR/Cas9）、广泛靶向代谢组学、网络药理学和分子对接等技术，对 NtSPS1 基因敲除的烟草（Nicotiana tabacum L. 品种 Hong Hua Da Jin Yuan，简称 HD）展开研究。最终发现，NtSPS1 敲除的 HD 烟草与野生型（WT）相比，有 48 种萜类物质发生变化，其中 6 种上调，5 种下调，特别是茄尼醇（solanesol）显著下调，含量降至野生型的四分之一，而化合物 1 和 8 则明显上调。此外，研究还表明化合物 36 展现出潜在的抗 TMV 活性，其抑制率可达 36.7%（IC₅₀=32.1 μM）。这项研究成果发表在《Scientific Reports》上，为烟草抗 TMV 研究提供了新的方向，也为寻找新型抗 TMV 物质提供了重要线索 。

在研究过程中，研究人员主要运用了以下关键技术方法：一是利用 CRISPR/Cas9 技术构建 NtSPS1 基因敲除的烟草植株；二是采用 LC-MS/MS 结合广泛靶向代谢组学技术分析萜类物质含量；三是借助网络药理学相关数据库筛选化合物及靶点，并构建化合物 - 靶点网络、蛋白质 - 蛋白质相互作用（PPI）网络；四是运用分子对接技术研究化合物与蛋白的相互作用；五是通过半叶法检测化合物的抗 TMV 活性。

下面来具体看看研究的结果：

• NtSPS1 突变体的获得：利用 CRISPR/Cas9 技术成功构建了 NtSPS1 基因敲除的 HD 烟草植株。经测序发现，有两个不同的突变位点，均为缺失 2 个碱基，且未检测到脱靶效应。同时，引入了暗红色标记，便于获得无转基因植株，并得到了足够的纯合 T₂群体，T₂代突变体植株表型与 WT HD 一致。
• 化学分析：通过广泛靶向代谢组学分析发现，T₂代突变体植株（HDK）和 WT 植株（HDS）在成熟阶段的整体代谢谱呈现明显的分离趋势，表明 NtSPS1 基因敲除后烟草叶片中的萜类物质发生了变化。PCA 分析显示，前 3 个主成分的累积贡献率大于 60%，其中 PC1 贡献率最大，为 43.67%。KEGG 通路富集分析表明，NtSPS1 敲除导致下游萜类物质如茄尼醇含量显著下降，尽管萜类物质的富集因子低于黄酮类和生物碱类，但萜类途径仍排名前三，其 p 值为 0.053（接近显著），FDR 低于 0.2，说明 NtSPS1 敲除后对萜类途径有调控作用。通过 LC-MS/MS 分析，鉴定并确认了 47 种萜类物质，包括 8 种单萜、23 种倍半萜、10 种二萜、6 种三萜。进一步分析发现，有 10 种萜类物质在 HDK 和 HDS 之间存在显著差异，6 种上调，5 种下调，37 种无明显变化。
• 网络药理学分析：构建化合物 - 靶点网络，共得到 150 个节点和 509 条边，其中绿色椭圆表示潜在的抗 TMV 靶点。通过疾病数据库筛选 TMV 的活性靶点，与化合物靶点对比后发现有 115 个共同靶点。构建 PPI 网络时虽未得到连接边，但仍利用此前确定的靶点进行后续研究。分子对接结果显示，化合物 16、18、23、27 和 36 能与 RSK 蛋白的结合位点良好结合，且与关键氨基酸残基形成氢键，表明这些化合物与 RSK 蛋白有较强的亲和力。
• 抗烟草花叶病毒活性测定：研究发现茄尼醇可能参与抗 TMV 过程，但 TMV 感染后，突变体（茄尼醇含量下降四倍）和野生型植株表现相似，说明可能有其他物质发挥抗 TMV 作用。经检测，化合物 36 对 TMV 有保护作用，IC₅₀为 32.1 μM。以宁南霉素为阳性对照，对 7 - 8 叶期的突变体烟草进行治疗实验，结果显示化合物 36 能显著减轻 TMV 对植株的危害，病变程度比宁南霉素处理组有所降低。

在讨论部分，研究人员指出，NtSPS1 基因敲除导致部分萜类物质积累差异，可能是由于 NtSPS1 基因的敲低抑制了部分化合物的合成，从而使得另一些化合物积累。同时，研究也存在一定的局限性，如 NtSPS1 敲除对烟草的化学和药理基础尚未完全明确，代谢组学数据库信息的精度和时效性有待提高，网络药理学和分子对接技术也存在一定的局限性，且仅初步确定了烟草萜类物质在治疗 TMV 中的关键靶点，未对生物学机制和重要通路进行深入探究。

总体而言，这项研究通过多种技术手段，全面分析了 NtSPS1 敲除对烟草萜类物质含量和抗 TMV 活性的影响，不仅为深入理解烟草萜类物质代谢调控机制提供了重要依据，也为开发新型抗 TMV 药物和培育抗 TMV 烟草品种奠定了理论基础。尽管研究存在一些不足，但也为后续研究指明了方向，具有重要的科学意义和应用价值。