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本文聚焦于聚合物工程化凝聚物在酶激活方面的研究。阐述了酶凝聚物的设计策略，探讨其激活机制，对比其他激活方法，指出未来挑战与方向，为酶催化创新及生物工程应用提供新思路。
引言
酶因能在温和条件下催化反应且具有生物相容性，在生物技术领域备受重视。但酶稳定性差、易失活，限制了其应用。目前虽有理性工程（rational engineering）和定向进化（directed evolution）等技术提升酶性能，但探索细胞内酶高效发挥功能的机制并模仿，是一种创新策略。
细胞内代谢酶常形成动态凝聚物，在多种生物和代谢途径中均有发现，其可作为瞬态反应枢纽，激活特定代谢途径。不过，细胞内酶凝聚物形成机制复杂，难以捉摸。因此，研究人员尝试在体外利用聚合物模拟酶凝聚物，以探究其对酶活性的影响。
酶凝聚物的设计策略
酶 - 聚合物凝聚物：酶作为支架
通过带电荷聚合物与酶相互作用可形成酶凝聚物，此时酶作为凝聚物形成的支架。依据目标酶的等电点（pI）选择带相反电荷的聚合物，并探索反应溶剂条件，如酶与聚合物的混合比例、pH 值等。
以粪肠球菌的 L - 乳酸氧化酶（LOX）为例，其 pI 约为 6，与 pI 约为 10 的聚赖氨酸（PLL）混合时能形成凝聚物并激活自身。但 LOX 与 PLL 的混合比例需优化，任何一种成分过多都会降低凝聚物形成速率。溶液 pH 值也很关键，处于两者 pI 值之间时易形成液滴状凝聚物，偏向某一成分则可能导致酶与聚合物相互作用过强而聚集，或过弱难以形成凝聚物。研究还发现，凝聚物形成的难易程度与酶的预测 pI 并不完全相关，还需考虑酶的整体电荷和局部表面电荷分布。
底物 / 辅酶 - 聚合物凝聚物：酶作为客体
当酶与聚合物简单混合无法形成凝聚物时，可将酶作为客体纳入由其他支架分子形成的凝聚物中。研究人员探究了将酶纳入核苷酸与聚阳离子形成的凝聚物。例如，三磷酸腺苷（ATP）作为许多酶反应的能量货币，易与阳离子聚合物和碱性蛋白质通过多价相互作用形成凝聚物。基于 ATP 的结构特征，发现烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）也具有很强的凝聚能力。
此外，核苷酸 / 聚阳离子凝聚物可提高反应效率。如 ATP - PLL 凝聚物促进己糖激酶（glucose + ATP→glucose 6 - phosphate + ADP）的结合，NADPH - PLL 凝聚物促进葡萄糖 - 6 - 磷酸脱氢酶（glucose - 6 - phosphate + NADP→glucono1,5 - lactone - 6 - phosphate + NADPH）的结合。这表明酶更易纳入与其亲和力高的分子形成的凝聚物中。
聚阳离子 - 聚阴离子凝聚物：酶作为客体
对于带互补电荷的聚合物 - 聚合物体系，折叠蛋白（包括酶）可被纳入预先形成的凝聚物中。研究人员以聚二烯丙基二甲基氯化铵（PDDA）和羧甲基葡聚糖（CMDX）体系为例，发现凝聚物的表面电荷取决于 PDDA 与 CMDX 的混合比例，PDDA 较多时表面带正电，反之带负电。
研究不同电荷状态的酶在不同 ζ 电位凝聚物中的结合情况，发现带正电的蛋白质更易纳入带负电的凝聚物，反之亦然。且酶在凝聚物中均匀分布，而非停留在表面，说明凝聚物具有流体性质，利于酶的稳定。这表明酶与凝聚物之间的静电互补性有助于酶的纳入和稳定。
基于聚合物的凝聚物形成策略的合理选择
酶 - 聚合物、底物 / 辅酶 - 聚合物和聚阳离子 - 聚阴离子这三种主要策略各适用于不同条件和目的。酶表面电荷明显偏向（如极端 pI 或电荷分布不均）时，酶 - 聚合物凝聚物策略最为直接；反应涉及带电荷且含磷酸基团的底物或辅酶（如 ATP、NADPH）时，底物 / 辅酶 - 聚合物凝聚物策略可能有效；前两种组合无法形成凝聚物或导致酶聚集时，聚阳离子 - 聚阴离子复合凝聚物策略可作为备选。
这些策略并非孤立，整合其发现可精细调控酶的纳入。例如，调整体系中核苷酸与聚合物、聚阳离子与聚阴离子的比例，可优化酶的纳入环境。同时，设计时应关注酶功能的增强，而非单纯的凝聚物形成。
凝聚物中酶激活的机制
酶凝聚物中酶反应效率的控制机制虽有不少理论，但部分仍待实验验证。一般认为，凝聚物中酶促反应所需分子（底物和酶）的局部组装增加了底物与酶的碰撞频率，支架蛋白也促进了两者的相互作用。此外，研究还发现了其他关键因素。
凝聚物的大小对酶激活至关重要。体外酶凝聚物大小与细胞内凝聚物（约几百纳米）不同，常被重构至几到几十微米。以 LOX 为例，添加少量盐（如硫酸铵）可调节其凝聚物大小，从亚微米级增至几微米。研究发现，亚微米级的 LOX 凝聚物比微米级的激活程度更高，NADH 氧化酶（NOX）也有类似趋势。这表明细胞内代谢途径可能受酶凝聚物体积大小的调节，较小的凝聚物具有更大的表面积与体积比，有利于酶促反应。
凝聚物内部独特的溶剂环境与本体溶液差异显著，可能导致酶构象变化，进而激活酶。凝聚物的介电常数与有机溶剂相近，其变化会影响酶的构象和活性。凝聚物中大分子浓度较高，通过分子拥挤效应影响蛋白质结构。研究发现，凝聚物形成过程中，氧化还原酶的二级结构虽整体保持，但局部会发生改变。凝聚物表面环境、与其他聚合物的相互作用等也会影响酶的构象和活性。
与其他酶激活方法的比较
与其他酶激活和稳定方法相比，凝聚物系统有其特点。凝聚物系统可分为基于添加带电荷聚合物和基于融合促进凝聚物形成的肽标签两类。后者虽能实现相分离，但需重组表达酶，可能降低酶的表达水平和活性。
酶工程是强大的酶激活方法，包括基于结构信息引入突变的理性设计和模拟自然选择的定向进化。其优势是能深入了解酶激活机制，但需要高通量的酶表达和功能筛选系统，技术难度较大。
酶固定化是酶实际应用的重要方法，通过将酶固定在表面可维持其稳定性和延长活性。常见方法有共价结合、物理吸附和包埋等。优点是便于酶的重复使用和回收，但固定化过程可能限制酶的流动性和底物扩散，影响反应效率。
胶束系统与凝聚物类似，可将酶从本体相中隔离出来。某些胶束系统利用亲水和疏水片段分隔酶，聚离子复合胶束还可提高抗非特异性吸附和降解能力。其优势是能明确分隔酶，增强酶稳定性，但可能限制底物进入，这方面凝聚物更具优势。
基于带电荷聚合物的凝聚物系统操作简单，仅需添加带电荷聚合物即可形成。但凝聚物的亚稳性可能导致稳定性问题，在实际环境中的可行性尚待研究，如在搅拌或混合过程中的剪切应力下，凝聚物能否形成并保持稳定。
未来方向和挑战
尽管酶凝聚物在增强酶活性方面潜力巨大，但目前应用局限于少数酶和体外凝聚物系统。要充分发挥其潜力，还需开展多方面研究。
将人工酶凝聚物固定在固体表面（如电极、生物传感器平台）具有重要意义。细胞内酶凝聚物与细胞器膜的相互作用常见，了解这些相互作用有助于将酶凝聚物整合到功能设备中。探索酶能否稳定地融合到固体表面，以及在干燥和再水化后能否保持高活性至关重要。修饰固体表面和调节凝聚物表面电荷可促进凝聚物的吸附和稳定。
针对特定靶酶设计优化的凝聚物形成聚合物也是关键研究方向。调节聚合物的电荷性质，如设计结合带电荷和中性基团的聚合物，可有效纳入折叠蛋白形成人工凝聚物。改变聚合物长度、设计嵌段共聚物，以及开发与靶酶表面残基相互作用的合成聚合物等策略，可控制酶凝聚物的性质，创造智能酶凝聚物，使其能响应环境信号并保持最佳酶活性。
构建能执行细胞内多步反应的酶凝聚物目前颇具挑战。现有研究尝试利用融合到内在无序蛋白凝聚结构域的酶进行两步酶促反应，但随着酶数量增加，融合、表达和纯化的工作量增大。利用易与聚合物形成凝聚物的 ATP 或 NADPH 等，在多步酶促反应中逐步纳入和激活所需酶，或基于细胞内酶凝聚物形成特点，选择聚合物促进特定酶的凝聚物形成和其他酶的聚集，可能是解决思路。
进一步增强酶凝聚物对酶的激活作用，可将凝聚物形成与其他激活方法结合产生协同效应。例如，基于酶的晶体结构在活性位点或其周围引入突变，可增强聚合物诱导的酶激活作用；增加折叠蛋白表面电荷的突变可促进与带电荷聚合物形成凝聚物。结合这些策略与从头酶设计，有望更好地利用酶。
结论
细胞内酶凝聚物通过复杂机制暂时形成，而在体外添加与酶多价相互作用的带电荷聚合物，可构建能激活酶的人工酶凝聚物。这种方法简单有效，可激活多种酶和两步连续反应。凝聚物大小、凝聚物内独特溶液环境引起的酶结构变化等因素可提高酶活性，深入理解这些机制有助于设计酶凝聚物。此外，文中还概述了酶凝聚物应用的基础研究方向和挑战，希望能为相关领域研究提供参考，推动酶凝聚物研究的发展。
