在医疗领域，准确、快速地检测临床病原体至关重要。据统计，2019 年全球约 1370 万人的死亡与病原体感染相关，其中 54.9% 由五种主要细菌病原体引起，血流感染（BSI）更是常见，每年病例超千万 。然而，当前临床细菌病原体诊断的金标准 —— 定量聚合酶链反应（qPCR）和培养方法，存在诸多弊端。qPCR 对超低病原体水平样本检测困难，灵敏度通常为0.1×104?105copies/mL，在检测低浓度病原体时易出现假阴性；血培养方法则依赖冗长的培养过程，耗时长达一周，且阳性率相对较低。此外，现有的 POC 诊断工具也难以满足临床对快速、精准、高效分析的需求。因此，开发一种高灵敏度、快速、高效的集成即时检测（POC）诊断方法迫在眉睫。

海南大学等机构的研究人员开展了相关研究，旨在解决临床病原体检测难题。他们开发了一种基于 CRISPR-CasΦ 的无靶点扩增旁切增强（TCC）技术。研究结果显示，TCC 技术检测限低至 0.11 copies/μL，在检测目标病原体基因时，灵敏度优于 qPCR。该技术能在 40 分钟内检测出血清中低至 1.2 CFU/mL 的病原菌，且具有良好的稳定性和重复性。这一成果发表在《Nature Communications》上，为临床病原体检测提供了新的有力手段，有望显著改善患者的诊断和治疗现状11112。

在研究方法上，研究人员主要采用了以下关键技术：一是优化反应体系，对 CasΦ 蛋白进行表达和纯化，并通过实验筛选出最佳的反应条件和核酸序列；二是构建 TCC 反应体系，利用设计的 TCC 放大器增强 CasΦ 的非特异性旁切活性；三是对临床样本进行处理和检测，包括对血清样本的处理、病原体的热裂解以及采用 qPCR、MALDI-TOF MS 等方法进行对比检测141516。

研究结果部分：

• TCC 工作原理：TCC 通过定制的 DNA 信号放大器实现一锅法等温无扩增 POC 诊断。目标病原体裂解后释放的 DNA 与 gRNA 和 CasΦ 结合，激活 CasΦ 的旁切活性，切割 TCC 放大器，产生的切割产物又能激活更多 CasΦ，从而实现荧光信号的指数级放大34。

• 超灵敏检测：TCC 能检测低至 0.18 aM 的双链 DNA（dsDNA）片段，对金黄色葡萄球菌（S. aureus）等病原体的检测限为 1.2 CFU/mL，且具有良好的单碱基识别能力，可有效区分单核苷酸多态性（SNPs）56。

• 直接检测病原体基因组：以培养的 S. aureus 为模拟样本，TCC 能在 40 分钟内完成病原体诊断，且对多种病原体具有广泛适用性，可通过设计特定的 gRNA 检测不同病原体78。

• 血清病原体感染的潜在 POC 诊断：TCC 在诊断血清样本中的病原体时表现出色，对大肠杆菌（E. coli）感染的诊断灵敏度达 100%，特异性为 88.64%，优于 qPCR。研究人员还开发了小型化荧光检测设备（TCC Device），验证了其在 POC 诊断中的可行性910。

研究结论和讨论部分：TCC 技术为血清中病原体检测提供了一种简化、快速且经济高效的诊断方法。与传统方法相比，TCC 具有更高的灵敏度和更快的检测速度，能有效诊断 BSI 样本中的低病原体浓度。同时，TCC 设备的开发展示了其在 POC 诊断中的临床潜力，具有广泛应用前景。然而，TCC 也存在一定局限性，如仅依赖单个 gRNA 识别病原体基因组可能受限，未来可通过改进引物或 gRNA 设计等方式，进一步拓展其在大规模病原体样本诊断中的应用111213。