蓝细菌Argonaute蛋白与Cas4家族核酸酶协同作用抵御外源DNA入侵的分子机制研究

这篇研究揭示了蓝细菌中长链A型原核Argonaute蛋白(pAgo)与Cas4家族核酸酶(ACE1)形成异源二聚体APACE1复合物的分子机制。研究发现APACE1系统通过小干扰DNA(siDNA)引导的DNA干扰和ACE1介导的siDNA加工，协同增强对质粒和噬菌体DNA的防御能力，为理解原核免疫系统进化提供了新视角。

　　

蓝细菌Argonaute与Cas4家族核酸酶的协同防御机制

Highlights
• pAgo与ACE1形成二聚体APACE1复合物
• APACE1通过siDNA引导实现DNA干扰
• ACE1作为单链DNA内切酶加工siDNA
• pAgo与ACE1协同抵御质粒和噬菌体DNA

引言
Argonaute蛋白(Agos)广泛存在于生命三域中。真核Argonaute(eAgos)是RNA诱导沉默复合体(RISC)的核心组分，而原核Argonaute(pAgos)则利用小干扰DNA(siDNA)抵御外源DNA入侵。pAgos可分为长链A型、长链B型和短链三类，其中长链A型pAgos通常作为独立免疫系统发挥作用。值得注意的是，某些长链A型pAgos与Cas4家族核酸酶共编码，但其功能关联尚不清楚。

结果
系统发育分析显示，与pAgo相关的Cas4家族酶(ACEs)形成两个独立进化分支：ACE1和ACE2。ACE1仅存在于蓝细菌中，而ACE2主要存在于厚壁菌门。通过解析CtAgo的晶体结构(2.4?)发现，其具有典型的双叶结构，包含催化DEDD四联体，与独立型长链A型pAgo结构相似。

生化实验证实，APACE1 pAgos能够介导siDNA引导的单链DNA切割。CtAgo和MaAgo均可使用14-30nt的5'-P或5'-OH siDNA引导切割ssDNA靶标，最佳活性温度分别为20-60°C和16-50°C。突变分析显示催化位点D533A/D537A会完全丧失酶活。

ACE1的结构与功能特征
CtACE1(1.56?)和MaACE1(2.07?)的晶体结构显示，它们具有典型的PD-(D/E)xK家族磷酸二酯酶核心结构，包含D-DxK催化三联体和Fe₄S₄铁硫簇。结构比对发现ACE1与DNA修复复合物AdnA/AddB的核酸酶结构域高度相似。生化实验证实ACE1是单链DNA内切酶，优先在鸟嘌呤核苷酸上游切割，产生5'-p-G末端产物。

APACE1复合物形成与功能调控
SEC和交联质谱分析表明，MaAgo与MaACE1形成约115kDa的异源二聚体，ACE1与pAgo的MID-PIWI叶相互作用。复合物形成后，ACE1活性增强，并能切割环状ssDNA等特殊底物。体内实验显示，ACE1可将pAgo结合的siDNA修剪至10-20nt，并增加5'-G siDNA的比例。

体内防御功能
在E. coli中表达MaAPACE1系统显示：
• MaAgo单独表达可降低2-3倍质粒转化效率
• 与MaACE1共表达时，质粒干扰效果增强至6-8倍
• 对噬菌体Bas01的防御需要MaAgo的催化活性
• ACE1单独表达也能适度降低细胞内质粒含量

讨论
该研究首次阐明了APACE1系统的分子机制，揭示了长链A型pAgos与辅助蛋白