解码古老脯氨酰 - 4 - 羟基化稳定胶原蛋白螺旋背后的立体电子效应奥秘

脯氨酰 - 4 - 羟基化（PTM）对胶原蛋白结构和功能至关重要，但相关立体电子效应间的相互作用未被充分认识。研究人员用校准的密度泛函理论（DFT）分析胶原肽（PO4G），揭示其稳定螺旋的机制，为理解胶原蛋白稳定性提供电子层面依据。

　　在生命的微观世界里，胶原蛋白就像一座大厦的钢筋框架，支撑着多细胞生物的结构。其中，脯氨酰 - 4 - 羟基化这一古老的进化保守的翻译后修饰（PTM），对胶原蛋白的结构和调节功能起着关键作用。它大量存在于胶原蛋白的 Yaa 位置，以 -Xaa-4-HyP-Gly-（(XO⁴G)）的形式，为胶原蛋白典型螺旋结构的形成和热稳定性提供了基础。然而，长期以来，这个微观过程中存在着诸多谜团。虽然人们知道脯氨酰 - 4 - 羟基化能稳定胶原蛋白的三螺旋结构，但具体的立体电子效应，包括吡咯烷环构象、扭转角、肽键异构化和电荷转移相互作用之间的优雅配合，却一直未被深入理解。以往的研究大多使用单氨基酸模型进行量子化学研究，无法全面阐释这些复杂效应之间的关系。而且，由于脯氨酰 - 4 - 羟基化引起的 Cγ -exo 环构象的稳定能量变化（ΔE_endo-exo）很小，接近现代密度泛函理论（DFT）方法的精度极限，这也给准确研究带来了困难。在这样的背景下，深入探究脯氨酰 - 4 - 羟基化稳定胶原蛋白螺旋背后的机制显得尤为重要。

为了解开这些谜团，印度理工学院曼迪分校的研究人员 Ashutosh Joshi、Trayambak Basak 和 Bhaskar Mondal 开展了一项重要研究。他们通过使用校准的 DFT 方法和生理相关的胶原蛋白 PO⁴G 三肽模型，对脯氨酰 - 4 - 羟基化所引发的各种立体电子效应进行了深入分析。研究结果表明，4 (R)- 羟基化促进了外式环构象，优化了主链扭转角，使反式肽键更稳定，同时通过调整 Bürgi-Dunitz 轨迹，最大化了 n→π相互作用（E_n→π=0.9 kcal/mol），还增强了吡咯烷环中轴向 C-H 电子与 C-OH轨道之间的 σ→σ相互作用。这些发现全面揭示了驱动胶原蛋白结构稳定的复杂立体电子效应，为理解胶原蛋白的稳定性提供了电子层面的基础，也为研究其他有助于胶原蛋白稳定的翻译后修饰奠定了基础。该研究成果发表在《iScience》杂志上。

在研究过程中，研究人员运用了多种关键技术方法。首先，他们对 24 种 DFT 泛函进行了校准，与金标准从头算方法（如域基对自然轨道耦合簇方法（DLPNO-CCSD (T)）和二阶微扰理论（MP2））进行对比，以确定最适合研究的 DFT 方法。其次，利用自然键轨道（NBO）分析，计算了 n→π和 σ→σ电荷转移相互作用的能量，量化了这些相互作用对胶原蛋白结构稳定的贡献。此外，他们还通过优化不同的氨基酸模型，从单氨基酸模型到包含氢键相互作用的 PO⁴G 三肽模型，逐步构建更符合生理相关性的模型进行研究。

下面详细介绍研究的主要结果：

1. DFT 泛函校准：研究人员将 DFT 泛函与从头算方法进行对比，以 4 (R)-HyP 的内式和外式环构象的相对能量（ΔE_endo-exo）为参数进行校准。结果发现，CAM-B3LYP、revTPSS 等多种 DFT 泛函与 MP2 估计的相对能量匹配度较高。进一步对 4 (S)-HyP 的异构体进行研究，确定了 M06、M052X 等泛函在预测相对能量方面更为准确，其中 M06 预测的 4 (R)-HyP 构象的 ΔE_endo-exo值最接近 MP2 值。
2. n→π^*电荷转移相互作用能量评估：通过 NBO 分析计算不同 DFT 水平下的 n→π电荷转移相互作用能量（E_n→π）。结果显示，PW6B95 预测的 E_n→π值最高，但因其在初级校准中预测的 ΔE_endo-exo值低于化学精度限制而被舍弃。最终确定 M062X 能合理准确地估计 ΔE_endo-exo值（1.1 kcal/mol）和较高的 E_n→π值（0.9 kcal/mol），适合用于后续研究。
3. 溶剂对几何结构的影响：以往研究多在气相中对脯氨酸衍生物进行量子化学研究，而该研究在气相和溶剂相（水）中对单氨基酸模型进行几何优化、频率计算和 NBO 分析。结果表明，溶剂相优化的几何结构更接近理想值，能更好地体现脯氨酰 - 4 - 羟基化的作用，说明溶剂对 n→π^*电荷转移相互作用的影响比环构象（ΔE_endo-exo）更大。
4. 生理相关胶原蛋白肽模型的构建：研究人员构建了 “三联体” 氨基酸模型 PO⁴G，以更准确地研究 n→π电荷转移相互作用和主链扭转角。通过不断优化模型，最终得到的 PO⁴G-(R)-exo 模型的几何参数与晶体结构接近，E_n→π值为 0.9 kcal/mol，与晶体结构计算值相似，可用于进一步研究。
5. 4-HyP 的位置偏好：通过比较含有不同 4-HyP 构象的 PO⁴G 三肽的几何参数、主链扭转角和电子参数，发现 PO⁴G-(R)-exo 的参数最接近晶体结构，E_n→π值最高，表明 4-HyP 在 Yaa 位置的外式环构象不仅能预组织主链扭转角，还能影响 n→π相互作用，稳定胶原蛋白结构。此外，研究还发现 4-HyP 在 Xaa 位置会导致几何结构偏差，不利于胶原蛋白螺旋结构的形成和稳定。
6. 反式肽键与电荷转移相互作用的相关性：研究人员通过对肽键扭转角的扫描，研究了反式肽键与电荷转移（n→π和 σ→σ）相互作用之间的关系。结果表明，反式肽键构象比顺式更稳定，肽键异构化会影响环构象和电荷转移相互作用。例如，从反式 / 反式构象转变为顺式 / 顺式构象时，n→π相互作用减弱，σ→σ相互作用也发生变化，环构象从外式转变为内式。

在结论和讨论部分，研究人员总结了脯氨酰 - 4 - 羟基化在实现胶原蛋白三螺旋稳定性过程中，不同立体电子效应之间的复杂相互作用。通过 PO⁴G 三肽模型，结合不同 4-HyP 构象和非羟基化的 PPG 三肽，揭示了 4-HyP (R)- 外式环构象的位置偏好。4-HyP 在 PO⁴G-(R)-exo 三肽中，通过优化主链扭转角，使肽键呈反式构象，调整 Bürgi-Dunitz 轨迹，实现了最高的 E_n→π值，同时其外式环构象因 σ→σ电荷转移相互作用而更加稳定，共同促进了胶原蛋白螺旋的稳定性。这项研究在电子层面深入理解了胶原蛋白螺旋稳定性的机制，为后续研究其他翻译后修饰对胶原蛋白稳定性的影响提供了重要参考，为生命科学领域研究胶原蛋白相关的结构和功能奠定了坚实基础，在生物医学和生物化学等相关领域具有重要的理论和实践意义。