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这篇综述聚焦精子中着丝粒蛋白 A（CENP-A），回顾其在成熟精子核中维持的证据，涉及人类、牛、小鼠和果蝇等物种。探讨其在父系遗传中的作用，以及与母系 CENP-A 对胚胎发育的影响，并提出相关未解决问题，值得一读。
引言
着丝粒在细胞分裂时，是染色体上与微管附着的关键区域，有助于遗传物质准确分配到子细胞。它位于串联重复的 DNA 序列中，但决定着丝粒位置的并非这些 DNA 序列，而是着丝粒蛋白 A（Centromeric Protein A，CENP-A），它是组蛋白 H3 的变体，能替代着丝粒处少量核小体中的组蛋白 H3 。
在体细胞中，CENP-A 与组成型着丝粒相关网络（constitutive centromere-associated network，CCAN）协同发挥作用，CCAN 包含 CENP-C 等蛋白，此外，CENP-B 能与 CENP-A 和着丝粒 DNA 结合 。在细胞周期中，尤其是有丝分裂过程中，这些蛋白的功能已相对明晰。然而，它们在减数分裂的生殖细胞以及配子中的作用，却研究甚少。
成熟精子的细胞核在精子发生过程中，会经历广泛的染色质重塑，大部分组蛋白被鱼精蛋白取代，仅 1 - 10% 的组蛋白保留在成熟哺乳动物精子的染色质中 。上世纪 80 年代的研究发现，CENP-A 可在鱼精蛋白结合的精子核中检测到，但由于精子染色质高度浓缩带来的技术难题，40 年后的今天，对成熟精子上特定着丝粒蛋白维持的了解仍很有限。许多关于精子着丝粒功能的认知，多源于果蝇（Drosophila melanogaster）和小鼠等遗传易处理的模式生物，人类相关研究因生殖组织和细胞难以获取而较少。本文旨在整合现有对果蝇和哺乳动物成熟精子中 CENP-A 维持和功能的认识，并对未来研究提供展望。
CENP-A 的发现 —— 精子的作用
对 CENP-A 在精子中维持和功能的理解，离不开对系统性硬皮病（Calcinosis, Raynaud phenomenon, Esophageal dysmotility, Sclerodactyly, and Telangiectasia，CREST 综合征）相关研究的回顾。早期用 CREST 综合征患者血清进行的研究发现，血清中含有识别细胞核内不同抗原，尤其是着丝粒的抗体 。1980 年，研究人员用 32 名 CREST 综合征患者的血清对多种小鼠组织和人类细胞系进行染色，在有丝分裂的各个阶段，均观察到与浓缩染色体相关的焦点。通过染色体涂片实验进一步证实，近三分之一的血清能识别着丝粒所在的初级缢痕 。后续的电子显微镜观察发现，这些焦点位于有丝分裂动粒上，在间期细胞中则靠近核膜和核仁 。1984 年，Earnshaw 等人用 CREST 血清对人类 HeLa S3 细胞的染色体染色，进一步确认了着丝粒定位 。1985 年，Earnshaw 和 Rothfield 通过蛋白质免疫印迹分析，鉴定出 CREST 血清识别的三种主要蛋白，分别命名为 CENP-A、CENP-B 和 CENP-C 。
同一时期，对小鼠睾丸进行 CREST 染色时发现，精子发生不同阶段着丝粒焦点分布不同，且减数分裂过程中着丝粒染色意外减弱 。1990 - 1991 年，Palmer 等人用成熟牛精子进行的一系列实验，成功分离出 CENP-A 蛋白。牛精子因其数量丰富且缺乏经典组蛋白，便于 CENP-A 的纯化。实验表明，CENP-A 存在于核部分，且与组蛋白共洗脱。经生化纯化和胰凝乳蛋白酶消化后，发现 CENP-A 与牛组蛋白 H3 有 50% 以上的序列同一性 。基于牛 CENP-A 序列，1994 年，人类 CENP-A 序列首次被克隆并鉴定为着丝粒特异性组蛋白 H3 变体 。
精子着丝粒上的 CENP-A：唯一的幸存者？
早期利用能识别 CENP-A、 -B 和 -C 的人类 CREST 血清来识别精子着丝粒，但当时并未直接评估 CENP-A 在精子上的特异性保留。最初对小鼠睾丸的染色未在成熟精子中检测到 CREST 信号，曾认为着丝粒蛋白在精子发生过程中丢失 。后来发现，这是由于成熟精子核高度浓缩，免疫荧光方法无法检测到。为此，研究人员开发了精子去浓缩方案，利用洗涤剂透化核膜、还原剂破坏富含半胱氨酸的鱼精蛋白之间的二硫键、肝素或其他聚阴离子通过电荷修饰从 DNA 中去除鱼精蛋白 。
上世纪 80 年代后期，CREST 血清首次应用于去浓缩的小鼠精子核。研究发现，着丝粒焦点主要位于钩状小鼠精子核的周边，且焦点数量与小鼠精子的单倍体染色体数不相关，这是着丝粒聚集的早期迹象之一。蛋白质免疫印迹显示，小鼠精子核部分中能检测到分子量为 18kDa 的 CENP-A，而未检测到 CENP-B 和 -C。不过，由于用 CREST 血清检测小鼠体细胞组织（胸腺和肝脏）时也仅识别出 CENP-A，与能识别 CENP-B 和 CENP-C 的人类淋巴瘤细胞不同，因此可能 CREST 血清无法识别小鼠的 CENP-B 或 -C 。直到近 20 年后，才用抗体确认了去浓缩成熟精子中 CENP-A 的染色 。最近，通过 CRISPR/Cas9 技术用红色荧光蛋白 mScarlet-I 标记内源性 Cenpa，首次在小鼠睾丸的细长精子中直接观察到内源性CenpamScarlet焦点，并通过蛋白质免疫印迹分析证实成熟精子中仅存在 CENP-A，不存在 CENP-B 和 CENP-C 。
1990 年，Palmer 等人用人类 CREST 血清对着丝粒进行免疫荧光染色，首次确定了牛精子中着丝粒的位置，蛋白质免疫印迹同样未检测到 CENP-B 和 CENP-C 。
在人类方面，上世纪 80 年代就将 CREST 血清应用于去浓缩的精子核，后续研究发现人类精子的着丝粒焦点分散在细胞核中，与牛精子类似 。2000 年代后期，用特异性识别 CENP-A 的纯化 CREST 血清，确认了人类精子中 CENP-A 的定位。实验中，将精子核与非洲爪蟾（Xenopus laevis）卵母细胞提取物孵育，模拟受精时自然发生的去浓缩过程，发现长时间孵育会导致 CENP-A 与着丝粒卫星 DNA 序列解离，CENP-A 向核边缘移动，而卫星 DNA 仍在染色中心有序排列，这暗示受精后合子中精子核可能发生类似的组织变化。
精子 CENP-A 的遗传和功能：来自果蝇的启示
十多年前，对果蝇的研究首次揭示了 CENP-A 的遗传规律及其在精子中维持的功能意义。在果蝇中，CENP-A 是成熟精子中唯一在组蛋白向鱼精蛋白转换过程中保留下来的着丝粒蛋白 。通过构建表达 EGFP 标记的 CENP-A 的转基因果蝇品系，克服了精子核免疫荧光检测的局限性，能够观察到成熟精子中明显的着丝粒焦点 。
为探究精子 CENP-A 的遗传模式，Raychaudhuri 等人追踪了受精后 CENP-AEGFP的定位 。他们发现，父系 CENP-A 在雄原核中可检测到，说明其在受精后鱼精蛋白转换和染色质重塑过程中稳定存在；同时，父系 CENP-A 会逐渐被母系翻译的 CENP-A 取代。这些实验首次证明，父系 CENP-A 可遗传，且在合子基因组激活（Zygotic Genome Activation，ZGA）前会被母系 CENP-A 稀释。
为研究父系遗传的 CENP-A 的功能重要性，研究人员利用 deGradFP 系统耗尽成熟精子中 GFP 标记的 CENP-A，结果发现，将精子 CENP-A 耗尽至检测不到的水平，会导致受精后胚胎致死，原因是父系染色体无法整合到第一次胚胎分裂的纺锤体中。在另一实验中，利用 GAL4 - UAS 系统在生殖系特异性驱动下耗尽 CENP-A，使成熟精子中 CENP-A 水平降至约 50%，结果在这些精子产生的胚胎中观察到 CENP-A 水平降低，且在三龄幼虫的成虫盘和成年雄性后代的生殖系中，着丝粒减弱的状态持续存在。这表明母系储备无法补充父系 CENP-A 耗尽的精子所带来的缺陷，且着丝粒处的 CENP-A 加载在合子分裂中是自我模板化的。因此，目前认为果蝇中父系 CENP-A 遗传的功能是作为跨代着丝粒维持的定量决定因素。
在果蝇（D. virilis）中，存在两种 CENP-A 旁系同源物 Cid1 和 Cid5 。体细胞仅表达 Cid1，生殖系细胞则表达两者。但在卵子和精子中，会分别保留其中一种。在雄性减数分裂中，Cid1 被去除，成熟精子中保留 Cid5；在雌性减数分裂中，Cid5 被去除，成熟卵母细胞中仅存在体细胞型的 Cid1 。受精后，早期胚胎中不存在 Cid5，在鱼精蛋白向组蛋白转换过程中，它似乎被母系来源的 Cid1 取代，这暗示 Cid5 具有精子特异性功能。在哺乳动物中也已鉴定出 CENP-A 变体，如牛基因组中，但尚未探索其潜在的功能特异性。
小鼠中精子 CENP-A 的遗传
哺乳动物中精子 CENP-A 的遗传和潜在功能重要性，直到最近才受到关注。2022 年，Das 等人构建了半合子Cenpa+/?小鼠，其 CENP-A 蛋白水平为野生型对照的一半 。为研究 CENP-A 的跨代遗传，他们让Cenpa+/?亲本杂交，并检测后代中 CENP-A 水平，发现雌性Cenpa+/+同窝幼崽生殖细胞中的着丝粒 CENP-A 水平恢复，雄性后代中则部分恢复，这表明小鼠中存在 CENP-A 的补偿性加载和 CENP-A 水平的表观遗传记忆，与果蝇中父系 CENP-A 的表观遗传记忆无法在胚胎中补偿的情况不同 。
通过野生型和Cenpa+/?亲本的一系列正反交实验发现，CENP-A 水平恢复正常取决于母本基因型。雌性半合子产生的后代中，雄性生殖系着丝粒持续减弱，与父本基因型无关；而野生型母本的后代中，父系着丝粒则完全恢复。此外，母本Cenpa+/?半合子的窝产仔数减少，表明着丝粒减弱和 CENP-A 水平降低会影响生殖适应性 。这些研究结果表明，CENP-A 在小鼠着丝粒强度的决定中是一个母系效应基因 。
在同一研究中，Das 等人还发现，即使在野生型合子中，亲本 CENP-A 水平也存在固有不对称性，母系着丝粒中的 CENP-A 含量约为父系着丝粒的两倍 。这种不对称可能是由于精子在鱼精蛋白向组蛋白转换过程中 CENP-A 丢失，或卵母细胞中 CENP-A 过度加载。不过，在小鼠合子基因组激活（ZGA）后的 4 细胞胚胎阶段，父系和母系同源染色体上的 CENP-A 分布趋于平衡，这表明这种平衡步骤可能是必要的，以防止同一细胞中出现强弱不同的着丝粒，避免它们在传递过程中竞争，类似于减数分裂中的着丝粒驱动现象 。目前尚不清楚在合子基因组激活时间比小鼠晚的人类或其他哺乳动物中，是否存在这种不对称性，以及是否需要亲本 CENP-A 的平衡事件。
精子着丝粒：未来 40 年的研究方向？
上世纪 80 年代利用 CREST 血清进行的研究，对 CENP-A 的发现和成熟精子核中着丝粒的初步检测至关重要，但成熟精子上究竟存在哪些着丝粒蛋白仍有待确定。在果蝇中，CENP-A 是唯一保留的着丝粒蛋白，因为该物种中另一种 CCAN 蛋白 CENP-C 在精子发生前就被去除 。在公牛精子中，未检测到 CENP-B 和 -C，但这可能是因为人类 CREST 血清无法识别牛的相关抗原。最近，用单克隆抗体进行的蛋白质免疫印迹分析证实，小鼠精子中仅保留 CENP-A，不存在 CENP-B 和 -C 。若能在人类精子中确认这一发现，将推动对早期胚胎发育及以后父系 CENP-A 跨代遗传的研究。
除了确定成熟精子上保留哪些着丝粒蛋白，还需了解 CENP-A 为何以及如何在精子中维持。果蝇研究已明确了精子中 CENP-A 维持对早期胚胎发育的功能重要性，但在哺乳动物胚胎发育中，精子 CENP-A 对父系染色体功能是否必不可少仍不清楚。为了解着丝粒维持的机制，需要研究 CENP-A 在鱼精蛋白化过程中的稳定性和动态变化，例如，CENP-A 在鱼精蛋白转换前后是否占据相同的 DNA 序列，它是以八聚体核小体形式、与组蛋白 H4 形成四聚体，还是作为唯一剩余的组蛋白存在，目前都不得而知。此外，在鱼精蛋白结合的环形结构包裹的 DNA 背景下，着丝粒染色质的组织方式也有待探索。CENP-A 在精子上保留的机制，可能涉及特定的组蛋白翻译后修饰，或与其他未知蛋白的独特保护性相互作用，这些可通过 CENP-A 纯化和质谱研究来探讨。此前，Del Mazo 等人就推测磷酸化可能是影响精子染色质包装，进而影响 CREST 血清抗原识别的机制之一 ，有趣的是，在小鼠配子中用抗 CENP-A 抗体进行免疫荧光显微镜观察的实验方案中，会使用 λ 磷酸酶来增加抗体对抗原的可及性 。了解 CENP-A 维持机制，也有助于明确其他 CCAN 成分在精子发生过程中何时以及如何被去除，目前尚不清楚这一过程是与经典组蛋白的去除、鱼精蛋白化相关，还是单个 CCAN 蛋白在哺乳动物精子发生的不同阶段发挥作用。此外，着丝粒 DNA 对功能性着丝粒维持的贡献也值得研究，确定与 CENP-A 结合的典型低甲基化区域（着丝粒凹陷区域，centromere dip region，CDR）在精子发生过程中是否精确维持，并遗传到成熟精子中，将是一个重要研究方向 。
解析 CENP-A 维持机制，与理解精子核内着丝粒的整体组织方式相关，这可能影响哺乳动物精子头部的形状。在人类和牛中，评估精子头部形态是预测生育力的标准程序，精子头部形态缺陷通常反映鱼精蛋白化或染色质状态异常 ，着丝粒结构异常可能也会反映在核形态缺陷上。在果蝇（D. melanogaster）精子中，四条染色体的四个着丝粒焦点在针状单倍体核中空间分离 ；在果蝇（D. virilis）中，五个着丝粒则聚集在精子核一端形成一个焦点 ；在哺乳动物精子中，着丝粒似乎在中心聚集形成染色中心 。这种包装方式可能有助于保护着丝粒免受 DNA 损伤，因为精子在到达雌性输卵管中的卵母细胞之前，会经过不同的环境。未来需要通过基于荧光原位杂交（Fluorescent in Situ Hybridisation，FISH）的着丝粒 DNA 映射研究，来确定整个鱼精蛋白化过程和成熟精子中着丝粒的整体空间组织和包装方式。
最后，减数分裂染色体分离异常常与不育相关，可能与精子中的着丝粒或 CENP-A 缺陷有关。对体外受精诊所捐赠的人类植入前胚胎进行开创性研究，对该领域的持续进展至关重要。人类诱导多能干细胞技术的发展，也可能为理解早期人类发育中着丝粒的动态变化和功能提供关键线索。在合适的动物模型中应用基因组编辑技术，将继续为人类生物学研究提供有价值的见解。遗传方法可与超分辨率成像和扩展显微镜技术相结合，克服核浓缩问题，以尽可能高的分辨率观察精子中的着丝粒结构。目前多个物种已完成端粒到端粒（Telomere-to-Telomere，T2T）的着丝粒组装，相关研究可借鉴这些成果，例如，长读长单分子方法 DiMeLo-seq 可精确绘制健康或异常精子中 CENP-A 核小体的位置 。在对 CENP-A 进行了 40 年的体细胞研究后，研究人员如今已掌握其详细的分子、生化和结构特性，这为揭示 CENP-A 在生殖系中的动态变化和功能，包括其在精子中的维持机制，以及评估其在受精和早期发育中的跨代重要性，奠定了良好基础。
