微氧条件下工程化大肠杆菌 W 高效生产异丙醇：可持续生物工艺的新突破

为解决异丙醇可持续生产问题，研究人员以大肠杆菌 W 为对象，探索微氧条件结合乳糖和酸乳清生产异丙醇的工艺。结果发现微氧条件下特定氧摄取率（qO2）与异丙醇生产相关，确定最佳qO2 。这为大规模微生物生产异丙醇奠定基础。

　　在当今时代，随着人们对生态环境的关注度不断提高，寻找可持续的燃料和大宗化学品供应路线成为了科研领域的热门话题。异丙醇作为一种应用广泛的化学品，在消毒剂、化妆品添加剂、燃料添加剂等多个领域都有着重要作用。然而，目前工业上生产异丙醇主要依赖于从蒸汽裂解获得的丙烯进行直接或间接水合，这种生产方式不仅依赖化石燃料，还会带来大量的温室气体排放。于是，开发一种更环保的微生物生产方法显得尤为重要。

在微生物生产异丙醇的研究中，虽然一些天然产异丙醇的菌株如拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii）和橙色丁酸梭菌（Clostridium aurantibutyricum）已被发现，但将其生产途径引入常用的大肠杆菌（Escherichia coli）中，通过代谢工程手段实现高效生产成为了研究的重点。此前的研究已经聚焦于乙酰辅酶 A（acetyl-CoA）和丙酮酸节点的代谢工程，但平衡生物质生长和异丙醇形成之间的碳通量仍然是一个关键难题。同时，营养限制作为一种调控微生物生长和生产的策略，在大肠杆菌中尚未得到充分研究，尤其是微氧条件与特定碳源结合的效果还不明确。

基于以上背景，维也纳技术大学（Technische Universit?t Wien）的研究人员 Regina Kutscha、Dominic Uhlir 和 Stefan Pflügl 开展了一项关于在工程化大肠杆菌 W 中通过氧限制提高可持续异丙醇生产的研究。他们的研究成果发表在《Microbial Cell Factories》上，为微生物生产异丙醇提供了新的思路和方法。

研究人员在实验过程中运用了多种关键技术方法。首先，他们使用了不同的大肠杆菌菌株，包括 E. coli W、E. coli W ΔldhA ΔadhE（KO2）和 E. coli W ΔldhA ΔadhE Δpta ΔfrdA（KO4） ，通过基因工程手段将来自丙酮丁醇梭菌（Clostridium acetobutylicum）和拜氏梭菌的相关基因导入这些菌株，构建出能够生产异丙醇的工程菌株。其次，采用摇瓶培养和生物反应器培养的方式，在不同条件下培养工程菌株，利用高效液相色谱（HPLC）技术对培养过程中的代谢产物进行定量分析。此外，通过微氧实验设计（DoE），改变搅拌速度和进气氧浓度，营造不同的微氧环境，并对实验数据进行统计分析，以探究微氧条件对异丙醇生产的影响。

研究结果主要围绕以下几个方面展开：

• 初步菌株筛选：研究人员对构建的三种大肠杆菌菌株在乳糖培养基上进行摇瓶实验，测试其异丙醇生产能力。结果显示，E. coli W_IPA 在生长阶段的生物量产量较高，且能产生大量异丙醇，其总体异丙醇产量达到碳平衡最大理论产量的 89%，而异丙醇的产生在生长阶段结束时才开始，证实了其生长解耦的生产过程。相比之下，敲除菌株（KO2 和 KO4）仅产生少量异丙醇，且生成更多的丙酮酸和乙酸，且乙酸不能被重新同化。由此可见，敲除菌株中删除的酶主要位于丙酮酸和乙酰辅酶 A 节点周围，这表明异丙醇生产对这些节点的通量变化非常敏感。
• 有氧培养实验：研究人员以乳清为碳源对 E. coli W_IPA 进行有氧生物反应器培养，包括分批培养阶段和碳限制补料分批培养阶段。在分批培养阶段，细胞消耗了培养基中的乳糖、半乳糖和乳酸，并产生少量乙酸和一定量的异丙醇。然而，在补料分批培养阶段，总体异丙醇产量下降到分批培养阶段的十分之一，细胞更倾向于生物量的形成。研究人员认为，这是由于在生长过程中，细胞对 ATP 的需求较高，碳源优先进入三羧酸循环（TCA cycle）以满足能量需求，导致没有足够的乙酰辅酶 A 用于异丙醇的合成。同时，NADPH 的供应也可能受到限制，使得丙酮无法进一步代谢为异丙醇。因此，碳限制的工艺策略不适合用于异丙醇的生产。
• 微氧条件的建立及影响：为了改善异丙醇的生产，研究人员考虑采用营养限制策略，由于乳清成分复杂，最终选择氧限制作为研究方向。通过设计一个二维中心复合表面设计实验，以搅拌速度和进气氧浓度为变量，在实验室规模的 1L 工作体积、通气速率为60 L h?1（1 vvm）的条件下进行实验。实验中，微氧条件被定义为溶解氧（DO）含量为 0%，不同的搅拌速度和进气氧浓度组合导致了不同程度的氧限制，从而产生了不同的平均特定氧摄取率（qO₂） 。结果发现，qO₂与特定异丙醇形成速率（qp,ipa）和异丙醇产量（Yipa/s）直接相关。在微氧条件下，细胞的生长、产物和副产物的形成呈现出不同的规律。例如，异丙醇和丙酮的形成速率以及细胞的特定生长速率与qO₂成正比，而乳酸和琥珀酸的积累则随着qO₂的增加而减少。此外，研究还发现搅拌速度对大多数代谢物的影响比进气氧浓度更大，但对于乙酸和甲酸的形成速率，进气氧浓度的影响更为显著。
• 微氧条件下的代谢分析：进一步对微氧条件下的中央碳代谢进行分析，研究人员发现丙酮酸节点是碳通量通向异丙醇的主要障碍。当qO₂低于2mmolg?1 h?1时，甲酸积累增加，同时丙酮酸也大量积累，这表明丙酮酸甲酸裂解酶（PFL）在将丙酮酸转化为乙酰辅酶 A 的过程中效率不高。此外，由于微氧条件下氧气供应有限，异丙醇的生产呈现出假生长耦合的现象，即细胞在生长的同时也能进行异丙醇的生产。同时，NADPH 的供应对于调节丙酮和异丙醇的比例至关重要，当qO₂接近厌氧条件（低于2mmolg?1 h?1）时，丙酮与异丙醇的比例增加，这可能是由于 NADPH 的短缺，因为在厌氧条件下，三羧酸循环活性降低，导致异柠檬酸脱氢酶（ICDH）和苹果酸酶（ME）等 NADPH 来源受到抑制，而戊糖磷酸途径的活性不足以补偿这种短缺。
• 确定最佳微氧条件及验证：综合以上研究结果，研究人员确定了轻度微氧条件（平均qO₂为9.6mmolg?1 h?1）是在乳糖上进行微氧异丙醇生产的最佳条件。为了验证这一结果，他们在乳糖和乳清上进行了生物重复确认实验，实验采用分批培养和随后的脉冲分批培养模式，搅拌速度恒定为 1000 rpm，进气氧浓度为 30%，通气速率为 1 vvm。结果表明，在微氧条件下，在乳糖和乳清上都能够实现高效的异丙醇生产，与有氧碳限制培养相比，异丙醇的产量分别提高了 2.3 倍（乳糖）和 5.7 倍（乳清） 。在微氧培养中，细胞呈现出假生长耦合的生产行为，即使在平均特定生长速率为0.084±0.003 h?1的情况下，仍然能够支持异丙醇的生产。

在研究结论和讨论部分，研究人员指出，他们成功建立了一种利用工程化大肠杆菌 W 从乳糖和乳清中高效生产异丙醇的生物工艺。通过对微氧条件的定量评估，揭示了qO₂与异丙醇形成（正相关）和副产物形成（负相关）之间的关系，为深入理解氧限制条件下细胞内的碳通量提供了重要依据。此外，微氧条件使得异丙醇的生产呈现出假生长耦合的特点，这为连续生产异丙醇提供了可能性。然而，要实现大规模生产，仍需要进一步优化工艺。例如，通过优化丙酮酸脱氢酶（PDH）和丙酮酸甲酸裂解酶（PFL）的活性，减少丙酮酸的积累，确保更多的碳流向异丙醇的合成；通过代谢工程手段优化菌株，增加 NADPH 的供应，提高异丙醇的产量和生产率；同时，建立合适的监测和控制策略，实时监控和调节qO₂，以维持微氧条件，确保大规模生产的稳定性和高效性。

总的来说，这项研究为可持续的大规模异丙醇生产奠定了坚实的基础，其研究成果对于推动微生物发酵生产化学品的发展具有重要的意义，有望为相关产业带来新的变革。