靶向降解 SARS-CoV-2 主蛋白酶（Mpro）：突破抗病毒治疗困境的新曙光

目前多数病毒感染缺乏有效抗病毒疗法，且易出现耐药问题。研究人员将 SARS-CoV-2 主蛋白酶（Mpro）抑制剂改造为靶向蛋白降解剂（TPDs）进行研究。结果显示 TPDs 抗病毒活性更强，对耐药病毒也有效。这为开发新型抗病毒药物提供了方向。

　　在全球范围内，病毒感染一直是威胁人类健康的重大难题。多数病毒感染缺乏有效的抗病毒治疗手段，现有的抗病毒药物不仅特异性强，仅对单一病毒有效，而且还常常面临耐药性的困扰。以新冠病毒（SARS-CoV-2）为例，它及其变异株在全球广泛传播，给公共卫生带来了巨大挑战。在对抗 SARS-CoV-2 的过程中，虽然研发出了一些药物，如临床批准的小分子抗病毒药物奈玛特韦（nirmatrelvir），它能与病毒主蛋白酶 M^pro（也称为胰凝乳蛋白酶样蛋白酶（3CL^pro）或非结构蛋白 5（Nsp5））的酶口袋结合，抑制病毒复制所必需的酶功能 ，但病毒很容易通过突变产生耐药性，比如 M^pro酶口袋中的 E166 位点突变就可能导致对奈玛特韦的耐药。因此，寻找更有效的抗病毒策略迫在眉睫。

在这样的背景下，来自澳大利亚莫纳什大学、日本东京大学等多个研究机构的研究人员开展了一项重要研究。他们致力于探究将 SARS-CoV-2 的 M^pro抑制剂改造成靶向蛋白降解剂（Targeted protein degraders，TPDs）是否能提升抗病毒活性，尤其是对耐药病毒的活性。最终研究发现，改造后的 TPDs 展现出比单纯酶抑制更强的抗病毒效果，对多种野生型和奈玛特韦耐药的 SARS-CoV-2 毒株都具有更高的抗病毒活性 。这一研究成果发表在《Communications Medicine》上，为未来开发更有效的抗病毒疗法带来了新的希望。

研究人员在这项研究中运用了多种关键技术方法。首先是细胞系相关技术，利用 HEK293T、VeroE6/TMPRSS2、Calu-3 等多种细胞系进行实验 。其次是蛋白检测技术，通过 Nano-Glo? HiBiT 裂解检测分析、Western blot、免疫沉淀（IP）等方法检测蛋白表达、降解及泛素化情况 。此外，还运用了抗病毒活性检测技术，如实时细胞分析（RTCA）、基于产量的抗病毒分析、定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）等评估 TPDs 的抗病毒效果。

研究结果具体如下：

• 合成并鉴定基于奈玛特韦修饰的 M^pro靶向 TPDs：研究人员合成了 33 种潜在的 TPDs，通过 FRET 分析筛选出对 M^pro有抑制作用的化合物，再利用基于多西环素（DOX）诱导的 M^pro-HiBiT 标签融合的定量报告分析，筛选出 BP-172、BP-174 和 BP-198 这三种能显著降低 M^pro-HiBiT 水平的化合物 。
• BP-172、BP-174 和 BP-198 时间依赖性降解 M^pro：在固定剂量 20μM 下，这三种化合物能显著降解 M^pro-HiBiT，其中 BP-198 在 24 小时内降解效果最佳，最大降幅达 72%，且这种降解并非由于细胞活力丧失 。
• BP-172、BP-174 和 BP-198 特异性结合 M^pro并招募泛素连接酶机制降解 M^pro：通过免疫沉淀实验，发现 BP-174 和 BP-198 处理后 M^pro-HiBiT 发生泛素化 。利用非降解性 M^pro抑制剂（NDMI）对照实验以及与游离未修饰奈玛特韦的竞争实验，证实这三种化合物能特异性结合 M^pro并引发其降解 。同时，通过构建 VHL 基因敲除细胞系，确认了 BP-172 的降解活性依赖于 VHL 。
• BP-174 和 BP-198 是有效的抗病毒药物，对 SARS-CoV-2 体外抗病毒效果增强：通过 RTCA 分析，发现 BP-198 和 BP-174 在多个浓度下比其 NDMI 对照能更有效地减少病毒细胞病变效应（CPE），具有更高的细胞指数和更长的达到 50% 细胞指数降低的时间（CIT₅₀） 。在针对 Omicron BA.5 毒株的实验中，BP-198 相较于 BP-206 在降低病毒滴度和病毒基因组数量方面表现更优 。
• TPDs 能有效降解携带奈玛特韦耐药突变的 M^pro：研究人员将几种已发表的奈玛特韦耐药突变引入 M^pro-HiBiT 表达系统，通过 HiBiT 分析和 Western blot 证实 TPDs 仍能降解突变的 M^pro-HiBiT 。
• BP-198 对奈玛特韦耐药的 SARS-CoV-2 体外有效：在针对奈玛特韦耐药的重组病毒的感染模型中，BP-198 对携带 M^pro突变（L50F/E166V）的 SARS-CoV-2 Delta 毒株的抗病毒活性比 BP-206 高 2.7 倍 。

在研究结论和讨论部分，研究证实了 SARS-CoV-2 M^pro抑制剂可改造为 TPDs，其抗病毒效果超越单纯酶抑制，对耐药突变体也有效。开发的定量细胞检测方法为筛选 TPDs 提供了关键工具。尽管部分化合物在初始筛选中效果不佳，但仍有少数如 BP-172、BP-174 和 BP-198 脱颖而出。与未修饰的奈玛特韦相比，TPDs 在细胞通透性等方面存在不足，但在针对耐药病毒时展现出优势。总之，该研究为抗病毒 TPDs 的发展迈出了重要一步，为未来治疗 SARS-CoV-2 感染等病毒感染性疾病提供了新的策略和方向，有望推动抗病毒药物的创新研发。