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在细菌信号转导中，组氨酸激酶（HKs）的激活机制尚不完全清楚。研究人员以枯草芽孢杆菌 DesK 和大肠杆菌 EnvZ 为对象，开展 HKs 激活机制研究。结果发现不依赖组氨酸磷酸化的别构偶联激活机制（HK-ACAM），这为理解细菌信号转导提供新视角。
在微观的细菌世界里，信号转导如同精密的 “通信网络”，掌控着细菌的生存与繁衍。组氨酸激酶（HKs）作为这个网络中的关键 “信号兵”，通过磷酸化特定蛋白质，调节其活性和定位，进而影响细菌的各种生命活动。以往研究认为，HKs 激活需保守组氨酸残基磷酸化，但一些响应调节因子（RR）却能通过非经典机制激活，其对应的激酶在无磷酸化情况下的别构激活机制仍迷雾重重。为解开这一谜团，来自阿根廷罗萨里奥国立大学（Universidad Nacional de Rosario）等机构的研究人员踏上探索之旅，相关成果发表于《Scientific Reports》 。
研究人员采用了多种关键技术方法。在突变体构建方面，通过设计诱变寡核苷酸，对 DesK 和 EnvZ 进行定点突变，构建多种突变体。借助分子动力学模拟（MDS），在计算机上模拟蛋白质间相互作用，深入探究 DesK 与 DesR 的结合模式及对 DesR 构象的影响。利用体外磷酸化分析，使用 γ-32P-ATP 标记，研究蛋白质的磷酸化和磷酸转移过程，明确关键氨基酸在信号转导中的作用。
研究结果如下：
- DesK 变体的体内分析：研究人员对 DesK 进行系列突变，将 His33?分别替换为丙氨酸（Ala）和酪氨酸（Tyr）。H335A 突变体无法激活 des 表达，而 H335Y 突变体表现类似野生型（WT），暗示 His33?磷酸化可能是激酶活性的次要磷酸化位点。进一步研究发现，H188Q 突变体虽缺失保守磷酸化位点 His1??，却能保持 59% 的 β- 半乳糖苷酶活性，表明存在不依赖 His1??磷酸化的激活机制。H335Q 突变体在体内也有活性，说明 His33?磷酸化并非严格必需，但对 DesK 功能至关重要。双突变体 H188Q/H335Q 完全丧失激活能力，证实 DesK 需 His1??或 His33?激活信号通路。
- DesK 的体外磷酸化：体外磷酸化实验表明，WT-DesKC 可自磷酸化，H188Q/H335Q 无此活性，H335Q 能自磷酸化但弱于 WT-DesKC，H188Q 则不能。在磷酸转移实验中，WT-DesKC 和 DesKC H335Q 可使 DesR 磷酸化，H188Q 和 H188Q/H335Q 则不行。这表明虽然自磷酸化和向 DesR 的磷酸转移需要 His1??，但 H188Q 变体仍能通过非磷酸化机制激活 Des 通路。
- 不饱和脂肪酸水平：测量表达 WT-DesK、H188Q 和 H335Q 变体的芽孢杆菌中不饱和脂肪酸水平发现，低温时三者不饱和脂肪酸水平相似，37°C 时均无不饱和脂肪酸。这说明 DesK 活性蛋白能有效调节 Des 通路终产物水平，维持脂质稳态。
- DesR 与 DesK 变体相互作用的计算机模拟分析：通过 MDS 模拟 DesR 与 WT-DesKC、H335Q 和 H335Y 变体的复合物，发现 WT 和 H335Y DesK 变体与 RR 相互作用时，保持 HTH 结构域更暴露的活性构象；H335Q 变体则诱导 HTH 结构域折叠，使 DesR 呈非活性构象。His33?与 DesR α?螺旋的适当相互作用可能是 HK-ACAM 激活 DesR 的必要条件。
- HK-ACAM 在其他 HKs 中的功能：研究人员对大肠杆菌 EnvZ 进行研究，将其保守的 His2?3 替换为谷氨酰胺（Gln）得到 H243Q 突变体。该突变体在高蔗糖浓度下能激活 ompC 转录，活性为 WT 的 65%，表明 His2?3 对 EnvZ 信号转导非必需，EnvZ 也存在不依赖磷酸化的机制。
研究结论与讨论部分指出，本研究揭示了即使 DHp 结构域中保守组氨酸残基缺失，HKs 介导的信号转导仍能进行，两性残基可促进信息传递。在 DesK 和 EnvZ 中均发现不依赖 HK 自磷酸化的别构机制 HK-ACAM，这一机制可能在不同细菌双组份系统中广泛存在。在正常条件下，经典磷酸化机制占主导；在营养限制或酸性等应激条件下，HK-ACAM 可能发挥关键作用。本研究为深入理解细菌信号转导机制提供新方向，有助于填补酶与假酶研究的空白，还为以 HKs 为靶点的抗生素研发提供理论依据，有望推动抗菌药物的创新发展，在生命科学和医学领域具有重要意义。
