调控 Mer 表达：解锁产甲烷古菌代谢奥秘，助力可再生能源生产

本文聚焦产甲烷古菌（Methanoarchaea），研究亚甲基四氢甲烷蝶呤还原酶（Mer）过表达的影响。发现 Mer 过表达在不同底物条件下对细胞生长、产甲烷及代谢效率影响各异，为工程改造微生物生产可再生燃料提供思路，极具科研价值。

　　

引言

产甲烷菌是严格厌氧的古菌，能通过产甲烷作用获取生长所需能量，在全球碳循环中发挥关键作用，每年在厌氧环境中贡献约 1 Gt 的 CH₄。它们可利用多种碳源进行产甲烷，如甲醇、乙酸、甲酸等，电子通量方向因碳源而异。

能量在产甲烷菌中通过电子传递与跨膜离子梯度偶联来保存。多酶复合物在产甲烷过程中至关重要，能促进底物和电子传递，提高反应速率。在 Methanosarcina acetivorans 中，能量保存型异二硫键还原酶（HdrED）与其他关键产甲烷酶形成复合物，可能作为 “氧化还原路由器” 协调碳固定和能量保存。

亚甲基四氢甲烷蝶呤还原酶（Mer）是甲基营养型产甲烷途径氧化分支的关键第一步，乙酰辅酶 A 脱羧酶 / 合成酶（ACDS）在不同代谢条件下负责乙酰辅酶 A 的合成或裂解。目前对产甲烷菌中碳和电子流的调控了解不足，限制了其在合成高价值生物产品或生物燃料方面的工程应用。研究假设增加 Mer 表达会影响 M. acetivorans 的生长、产甲烷速率、生物质效率及对底物变化的适应性，进而展开研究。

材料和方法

1. 培养条件：实验所用 M. acetivorans 菌株在严格厌氧条件下，于定制 B 型 Coy 厌氧培养箱中培养，内部环境为 5% H₂/20% CO₂/75% N₂。菌株接种到添加甲醇（125 mM）或乙酸（120 mM）的高盐（HS）培养基中，适应特定碳源后可切换培养基。培养在玻璃 Balch 管中进行，固体培养基添加 1.4% 琼脂，在特定气体环境下培养。
2. 质粒和菌株构建：采用已有的遗传操作方法，利用 PCR 扩增目的基因，引物由 Integrated DNA Technologies 合成，PCR 产物克隆到 pNB730 载体质粒，通过脂质体转染将质粒导入 M. acetivorans。所有质粒经 PCR 筛选和测序验证。
3. PAGE 和免疫印迹：样品在 4% - 20% 梯度 SDS - PAGE 凝胶上分离，转移到 PVDF 膜，按特定系统协议检测蛋白质，使用相应抗体和底物检测信号。
4. 细胞生长测量：用分光光度计在 600 nm 处测量培养物的光密度，计算细胞群体的生长速率，进行统计分析评估显著性。
5. 生物质测量：细胞生长至稳定期后，通过真空过滤收集在 PVDF 膜上，干燥称重，确保水分完全蒸发。
6. 产甲烷测定：菌株培养至早期稳定期，离心洗涤后重悬，准备样品进行气相色谱分析，检测顶空中的 CH₄含量。
7. 代谢效率计算：根据生长速率（k_g）和产甲烷速率（k_CH4）的关系计算代谢效率，并归一化到亲本菌株。

结果

1. Mer 过表达菌株的构建：构建 pNB746 和 pMW1 质粒，将扩增的 Mer 基因克隆到过表达载体 pNB730 中，转染后整合到 M. acetivorans 染色体上。通过 PCR 筛选、SDS - PAGE 和免疫印迹验证质粒成功整合和 Mer 蛋白过表达，且发现天然未标记的 Mer 与过表达的 Mer^{his - strep}共纯化，表明体内形成动态异源寡聚体。
2. Mer 过表达对底物适应细胞生长速率和生物质生产力的影响：适应甲醇的 Mer 过表达菌株（NB210 和 NB249）比亲本菌株生长更快，但生物质产量降低；在乙酸上生长时，Mer 过表达对生长、生物质和甲烷产量无显著影响，但标记的 Mer 过表达菌株（NB249）生物质生产力显著下降，细胞更小。整体代谢效率在适应乙酸或甲醇时无显著变化。
3. Mer 过表达在底物切换时的显著变化：适应甲醇后切换到乙酸，Mer 过表达菌株生长变慢，但生物质增加，产甲烷速率加快，代谢效率降低；适应乙酸后切换到甲醇，天然 Mer 过表达菌株（NB210）生长更慢，生物质减少，产甲烷速率略快，代谢效率略有增加但不显著，且两种过表达菌株细胞均比亲本菌株小。

讨论

Mer 过表达对 M. acetivorans 代谢有显著影响。在甲醇上，它使生长加快、生物质减少，可能是将还原当量转移到氧化分支，牺牲了通过 Cdh/ACS 合成乙酰辅酶 A 的过程。在乙酸上，适应多代后细胞可能调整了基因表达，使各项指标与亲本菌株相似。

底物切换时，从甲醇切换到乙酸，标记的 Mer 过表达导致生物质增加和产甲烷加快；从乙酸切换到甲醇，天然 Mer 过表达导致生长变慢、生物质降低、产甲烷通量略快。

产甲烷作用具有生化可逆性，Hdr:ACDS:Mer 复合物对代谢灵活性很重要。Mer 过表达可能改变复合物的化学计量，影响其功能。标记的过表达菌株与未标记菌株表现不同，可能是标签影响了蛋白质相互作用。

Mer 过表达还可能影响细胞内信号传导，但目前对 Methanosarcina 细胞如何感知和响应细胞内代谢物池变化了解不足。总之，控制 Mer 表达对调节甲基营养型和乙酸裂解型产甲烷途径的氧化分支碳通量至关重要，该研究对产甲烷菌和利用 Wood - Ljungdahl 途径的微生物有广泛意义 。