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乙肝（HBV）感染威胁全球健康，清除乙肝表面抗原（HBsAg）是实现功能性治愈的关键。本文发现小乙肝表面抗原（SHBs）经泛素 / 蛋白酶体途径降解，TRIM21 促进其降解，OTUD4 则稳定它。这为乙肝相关肝病治疗提供新思路，值得关注。
乙肝病毒感染与 SHBs 的重要作用
乙肝病毒（HBV）感染是全球性的重大健康问题，全球约有 2.96 亿人感染，每年导致约 100 万人死亡。HBV 的基因组编码多种蛋白，其中乙肝表面抗原（HBsAg）包含大、中、小三种成分（LHBs、MHBs 和 SHBs）。慢性 HBV 感染会显著增加患肝细胞癌（HCC）的风险，而清除 HBsAg，尤其是 SHBs，能够抑制 HBV 复制，降低患 HCC 的风险，是实现 HBV “功能性治愈” 的关键。
SHBs 是 HBV 中含量最为丰富的病毒蛋白，在病毒的复制和逃避免疫系统攻击中发挥着重要作用。它可以激活高尔基体蛋白 73，抑制特定免疫因子，从而帮助 HBV 复制；还会引起内质网（ER）应激，触发自噬、血管生成和转移等多种细胞过程；此外，SHBs 能够通过激活环磷酸腺苷（cAMP）/ 蛋白激酶 A（PKA）/cAMP 反应元件结合蛋白（CREB）信号通路，促进肝糖异生。鉴于 SHBs 在 HBV 生命周期中的关键作用，抑制 SHBs 有望阻碍 HBV 诱导的肝癌发生，深入了解 SHBs 的降解途径对于开发治疗 HBV 相关肝病的新方法至关重要。
SHBs 的降解途径探究
此前，SHBs 的降解过程及机制尚不清楚。研究人员为了确定 SHBs 是通过蛋白酶体还是自噬 - 溶酶体途径降解，用蛋白酶体抑制剂 MG132、溶酶体蛋白酶抑制剂（E64D + 胃蛋白酶抑制剂和亮抑酶肽 + NH4Cl）以及自噬抑制剂巴弗洛霉素 A1 处理表达 SHBs 的肝癌细胞。结果显示，MG132 能有效抑制 SHBs 的降解，而针对自噬 - 溶酶体途径的抑制剂则没有明显效果。
由于泛素化介导的蛋白酶体降解途径在蛋白质降解中起着关键作用，研究人员进一步探索 SHBs 是否经历这种修饰。将表达泛素的质粒导入表达 SHBs 的肝癌细胞后，通过免疫沉淀实验发现 SHBs 确实会被泛素修饰。已知 K48 连接的多聚泛素化会标记蛋白质进行蛋白酶体介导的降解，研究人员经检测证实 SHBs 会发生 K48 连接的多聚泛素化。同时，研究还发现 LHBs 和 MHBs 也会经历 K48 连接的多聚泛素化，这表明 HBsAg 中的多种成分都存在类似的泛素化修饰。这些结果表明，SHBs 主要通过蛋白酶体途径降解，并发生 K48 连接的多聚泛素化。
K122 位点在 SHBs 降解中的关键作用
基因型 B 的 HBV 的 SHBs 蛋白含有四个赖氨酸（K）残基。为了确定 SHBs 上 K48 连接的多聚泛素化的具体位点，研究人员构建了赖氨酸被替换为精氨酸（K to R）的突变体，包括 K24R、K122R、K141R 和 K160R。将这些突变体与 HA 标记的 K48 连接的多聚泛素化一起导入肝癌细胞后，通过免疫印迹分析发现，与野生型 SHBs（SHBs/wt）相比，SHBs/K122R 突变体的多聚泛素化水平显著降低，而其他突变体的多聚泛素化水平与 SHBs/wt 相比没有明显变化。进一步将 SHBs 中的所有 K 残基替换为 R（SHBs/KallR），其多聚泛素化水平与 K122R 突变体相似，这表明 K122 是 SHBs 的主要多聚泛素化位点。
为了评估 K122R 突变对 SHBs 降解的影响，研究人员进行了环己酰亚胺（CHX）追踪实验。用表达 SHBs/wt - Flag 或 SHBs/K122R - Flag 的质粒转染 Huh7 和 HepG2 细胞，然后持续用 CHX 处理不同时间。结果显示，SHBs/K122R 突变体在 Huh7 和 HepG2 细胞中的半衰期显著延长，分别从 124 分钟延长到 181 分钟，从 98 分钟延长到 475 分钟。此外，将 SHBs 中的 K122 残基替换为丙氨酸（SHBs/K122A）后发现，在蛋白酶体抑制剂 MG132 存在的情况下，SHBs/K122A 突变体的 SHBs 水平仅略有增加，而野生型 SHBs 的蛋白水平则大幅升高。这些结果充分表明，K122 位点对于泛素 - 蛋白酶体介导的 SHBs 降解至关重要。
与 SHBs 相互作用的泛素修饰酶的鉴定
蛋白质的翻译后修饰是由修饰酶与蛋白质底物之间的相互作用引起的。研究人员首先将表达 K48UB 的质粒导入表达 SHBs 的 Huh7 细胞，并用蛋白酶体抑制剂 MG132 处理，以阻断 26S 蛋白酶体复合物的蛋白水解活性。对细胞裂解物进行免疫沉淀、SDS - PAGE、胶内胰蛋白酶消化，然后用液相色谱 - 串联质谱（LC - MS/MS）分析所得肽段。LC - MS/MS 分析共鉴定出 1726 种可能与 SHBs 结合的蛋白质，在其中搜索 E3 泛素连接酶和去泛素化酶后，发现了两种 E3 泛素连接酶和五种去泛素化酶可能与 SHBs 结合。其中，TRIM21（一种 E3 泛素连接酶）和 OTUD4（一种去泛素化酶）表现突出，被确定为可能与 SHBs 相互作用的关键蛋白。
SHBs 与 TRIM21 的相互作用及 TRIM21 对 SHBs 的调控
将表达 SHBs - Strep - Flag 和 TRIM21 - myc 的质粒共转染到 Huh7 细胞中，通过共免疫沉淀实验，利用抗 Strep 抗体进行免疫沉淀，并用抗 TRIM21 抗体检测，证实了 SHBs 与 TRIM21 之间的相互作用。此外，将表达 TRIM21 - Strep - Flag 和 SHBs - Flag 的质粒共转染到 Huh7 细胞中，进行同样的实验也得到了相同的结果。体外 GST 下拉实验也表明，GST 标记的 TRIM21 能够成功沉淀体外翻译的 SHBs。
TRIM21 含有四个结构域（RING、B - Box、卷曲螺旋和 PRY - SPRY），为了确定哪个结构域与 SHBs 结合，研究人员构建了每个结构域的缺失突变体。GST 下拉实验结果显示，TRIM21 的卷曲螺旋结构域对其与 SHBs 的相互作用至关重要。
作为 E3 泛素连接酶，TRIM21 能够促进蛋白质的泛素 - 蛋白酶体降解。研究人员将表达 TRIM21 - myc、SHBs - Flag 和 HA - K48UB 的质粒共转染到 HepG2 或 Huh7 细胞中，同时加入 MG132。结果发现，TRIM21 的过表达显著增强了 SHBs 的多聚泛素化水平；用两种特异性小干扰 RNA（siRNAs）沉默 TRIM21 后，SHBs 的多聚泛素化水平降低。在肝癌细胞中过表达或敲低 TRIM21，结果显示 SHBs 蛋白水平随着 TRIM21 表达量的增加而逐渐下降，而 TRIM21 缺失卷曲螺旋结构域的突变体则不会影响 SHBs 蛋白水平。
用 CHX 处理细胞以评估 TRIM21 对 SHBs 稳定性的影响，发现提高 TRIM21 水平会显著缩短 SHBs 的半衰期，在 Huh7 细胞中从 98 分钟缩短到 69 分钟，在 HepG2 细胞中从 109 分钟缩短到 76 分钟。比较 SHBs/K122R 突变体和 SHBs/wt 的多聚泛素化情况发现，TRIM21 能够增加 SHBs/wt 的多聚泛素化，但对 SHBs/K122R 突变体没有这种作用。这些结果表明，TRIM21 通过 K122 位点促进 SHBs 的多聚泛素化和随后的蛋白酶体降解，其卷曲螺旋结构域对影响 SHBs 蛋白水平至关重要。
SHBs 与 OTUD4 的相互作用及 OTUD4 对 SHBs 的调控
OTUD4 是一种已知的能够稳定蛋白质的 K48 特异性去泛素化酶。将表达 SHBs - Strep - Flag 和 OTUD4 - Flag 的质粒共转染到 Huh7 细胞中，通过共免疫沉淀实验证实了 OTUD4 与 SHBs 之间的相互作用；同样，将表达 OTUD4 - Strep - Flag 和 SHBs - Flag 的质粒共转染到 Huh7 细胞中进行实验，也得到了相同的结果。体外 GST 下拉实验表明，SHBs - Flag 能够直接与 GST - OTUD4 相互作用。
为了确定 OTUD4 与 SHBs 相互作用的区域，研究人员构建了一系列 OTUD4 缺失突变体。GST 下拉实验结果显示，OTUD4 的 1 - 180 位氨基酸区域对于其与 SHBs 的结合是必要且充分的。
作为卵巢肿瘤（OTU）家族的成员，OTUD4 能够切割 K48 连接的多聚泛素链。研究人员通过免疫沉淀实验研究 OTUD4 对 SHBs 多聚泛素化的影响，发现 OTUD4 过表达会显著降低 SHBs 的多聚泛素化水平，而沉默 OTUD4 则会导致 SHBs 多聚泛素化水平升高。OTUD4 过表达会显著提高 SHBs 的蛋白水平，且这种增加呈剂量依赖性，当 OTUD4 缺失 1 - 180 位氨基酸时则不会出现这种增加；相反，用 siRNA 降低 OTUD4 水平会导致 SHBs 蛋白水平下降。
用 CHX 处理共转染了表达 OTUD4 - myc 和 SHBs - Flag 质粒的 Huh7 细胞，发现 OTUD4 过表达显著延长了 SHBs 的半衰期，在 Huh7 细胞中从 97 分钟延长到 162 分钟，在 HepG2 细胞中从 89 分钟延长到 204 分钟。比较 OTUD4 对 SHBs/K122R 突变体和 SHBs/wt 多聚泛素化水平的影响，发现 OTUD4 能够降低 SHBs/wt 的多聚泛素化，但对 SHBs/K122R 突变体没有影响。这些结果表明，OTUD4 通过其去泛素化活性增加 SHBs 的稳定性，其 1 - 180 位氨基酸残基对影响 SHBs 蛋白水平至关重要。
OTUD4 与 TRIM21 的竞争关系对 SHBs 的影响
TRIM21 作为 E3 泛素连接酶，OTUD4 作为去泛素化酶，在 SHBs 蛋白的降解过程中发挥着相反的作用。研究人员推测 OTUD4 可能与 TRIM21 竞争，影响 SHBs 的多聚泛素化和稳定性。实验结果显示，当 OTUD4 过表达时，通常由 TRIM21 增强的 SHBs 多聚泛素化水平显著降低，这表明 OTUD4 有效地抵消了 TRIM21 诱导的泛素化。此外，OTUD4 过表达不仅降低了 SHBs 的多聚泛素化，还减轻了 TRIM21 通常引起的 SHBs 蛋白水平的下降。这些结果支持了 OTUD4 与 TRIM21 相互对抗，通过减少 SHBs 的多聚泛素化来影响其稳定性的观点。
SHBs 泛素化对其致癌活性的影响
先前的研究表明，SHBs 能够通过上调血管内皮生长因子 A（VEGFA）的表达来增强 HCC 细胞的迁移和血管生成能力。研究人员转染表达 SHBs - Flag 和 OTUD4 - myc 或 TRIM21 - myc 的质粒到 Huh7 细胞中，发现引入 TRIM21 显著降低了表达 SHBs 的 Huh7 细胞的迁移能力，而 OTUD4 过表达则增强了 SHBs 促进细胞迁移的能力。在研究 SHBs 对血管生成的影响时，发现过表达 TRIM21 的 SHBs 表达细胞的培养基中，SHBs 上调 VEGFA 表达和促进人脐静脉内皮细胞（HUVECs）管形成的能力显著降低；相反，过表达 OTUD4 则增强了 SHBs 的这些能力。用 siRNA 敲低 TRIM21 或 OTUD4 的表达会产生相反的结果。这些结果表明，TRIM21 和 OTUD4 可以通过调节 SHBs 的蛋白水平来改变其功能，进而影响 Huh7 细胞的迁移和 HUVECs 的血管生成能力，在 SHBs 相关的 HCC 发病机制中具有潜在的重要意义。
TRIM21 和 OTUD4 对亚病毒颗粒和病毒粒子产生的影响
HBsAg 在免疫反应、HBV 感染、病毒粒子产生和潜在的 HBV 治愈中都起着至关重要的作用。研究人员进行了一系列实验来评估 TRIM21 和 OTUD4 对 HBsAg 和病毒粒子产生的影响。结果显示，在 Huh7 和 HepG2 细胞中过表达 TRIM21 会导致细胞内 HBsAg 和 HBV DNA 减少，细胞外 HBsAg、HBeAg 和 HBV 病毒粒子滴度显著降低；敲低 TRIM21 则会导致细胞内和细胞外 HBsAg、HBV DNA 水平显著升高，细胞外 HBeAg 增加。相反，过表达 OTUD4 会使细胞内 HBsAg、HBV DNA 以及细胞外 HBsAg、HBeAg 和 HBV 病毒粒子 DNA 增加；用 siRNA 沉默 OTUD4 表达则会导致这些标志物下降。在表达 HBV 基因型 D 的 HepG2.215 细胞中也得到了类似的结果。这些结果表明，TRIM21 和 OTUD4 对 HBV 产生的调节可能涉及对 HBV 复制和分泌过程的影响，可能与 SHBs 表达增加诱导 ER 应激、促进自噬和增强 HBV 复制有关。
研究总结与展望
尽管有 HBV 疫苗，但慢性 HBV 感染仍然是全球重大健康问题。目前实现治疗停止后 24 周内 HBsAg 消失的 “功能性治愈” 在现有治疗中很少见。为了清除 HBsAg，人们开发了多种治疗策略，如小干扰 RNA、反义寡核苷酸、RNA 干扰和抗体介导的清除等，但这些方法都存在一定的局限性。因此，研究新的 HBsAg 清除方法至关重要。
本研究表明，SHBs 主要通过蛋白酶体途径降解，且发生 K48 连接的多聚泛素化，K122 是关键的泛素化位点。E3 泛素连接酶 TRIM21 和去泛素化酶 OTUD4 直接与 SHBs 蛋白相互作用，TRIM21 促进 SHBs 的泛素化和降解，OTUD4 则通过去泛素化稳定 SHBs。两者在调节 SHBs 的稳定性和功能方面发挥着重要作用，它们之间的动态相互作用影响着 HBV 的发病机制和病毒粒子的产生。
研究还发现，TRIM21 和 OTUD4 对 SHBs 相关的功能，如细胞迁移、血管生成以及亚病毒颗粒和病毒粒子的产生都有显著影响。通过调节 TRIM21 和 OTUD4 的表达或活性，有望抑制 SHBs 相关的致癌过程，降低 HBsAg 和其他病毒标志物的水平。因此，靶向 OTUD4 的抑制剂和 TRIM21 的激活剂可能是治疗 HBV 相关疾病的有前景的抗病毒策略。
未来，进一步研究 TRIM21 和 OTUD4 在不同 HBV 基因型中的作用，以及它们与其他细胞因子的相互作用，将有助于更深入地了解 HBV 的发病机制，为开发更有效的治疗方法提供坚实的理论基础。
