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鬼臼毒素（PPT）有抗病毒、抗癌特性，但肺毒性限制其应用。本文基于毒理学证据链（TEC）理论，发现 PPT 致大鼠肺损伤，还改变肠道和肺微生物群及代谢物。揭示肠道 - 肺轴在 PPT 肺毒性中的作用，为减轻其副作用提供思路。
研究背景
鬼臼毒素（Podophyllotoxin，PPT）源自传统药用植物，如八角莲属（Dysosma）等，具有抗病毒、抗炎、抗癌等多种生物活性 。然而，其显著的毒性和严重的胃肠道副作用限制了临床应用，肺是其毒性作用的关键靶器官之一，但 PPT 致肺毒性的机制尚不明确。2019 年研究团队引入毒理学证据链（Toxicological Evidence Chain，TEC）概念评估中药毒性，本研究基于此概念，探究 PPT 致肺毒性的机制以及 “肠道 - 肺轴” 在其中的潜在作用。
材料和方法
- 动物和实验设计：选用 42 只 SPF 级雄性 SD 大鼠，适应性饲养 1 天后，随机分为 PPT 溶液组（22 只）和对照组（20 只）。PPT 组每日灌胃（i.g.）20mg/kg 的 PPT 溶液，对照组给予溶媒，持续 4 天。
- 损伤表型表现（Injury Phenotype Evidence，IPE）：观察大鼠行为和生理反应，包括腹泻、出血、死亡情况，以及面部、眼睛、爪子和皮毛颜色变化等，每日测量体重，通过步态评分评估运动功能和协调性，计算肺器官指数衡量肺部潜在病理变化。
- PPT 诱导肺毒性的毒理学研究（Adverse Outcome Evidence，AOE）：使用 ELISA 试剂盒测定肺组织中肿瘤坏死因子 -α（TNF-α）、白细胞介素（IL）-18、IL-6、IL-1β 等促炎细胞因子水平，采用硫代巴比妥酸法测定丙二醛（MDA）含量，用 5,5'- 二硫代双（2 - 硝基苯甲酸）法测量还原型谷胱甘肽（GSH）水平，使用全自动生化分析仪检测支气管肺泡灌洗液中总蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、碱性磷酸酶（ALP）和乳酸脱氢酶（LDH）含量。同时，对肺组织进行苏木精 - 伊红（H&E）染色，观察病理变化。
- PPT 诱导神经毒性的多组学分析（Toxicological Event Evidence，TEE）：对大鼠肺组织和肠道内容物进行 16S rRNA 基因测序，分析微生物群落结构和功能变化；采用气相色谱 - 质谱联用（GC-MS）技术检测大鼠粪便中短链脂肪酸（Short-Chain Fatty Acids，SCFAs）含量；通过偏最小二乘法判别分析（PLS-DA）等方法对代谢物数据进行分析，并进行京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析。此外，对差异物质进行 Spearman 相关性分析，探究肠道微生物群、肺微生物群、SCFA 代谢物和炎症细胞因子之间的相互关系。
- 统计分析：运用 SPSS 21 和 GraphPad Prism 8.0 软件进行统计分析，数据以均值 ± 标准差表示，符合正态分布和方差齐性的数据采用 Student's t 检验，非参数数据使用 Wilcoxon 秩和检验，设定 P<0.05 为差异具有统计学意义。
研究结果
- PPT 诱导的 IPE：给药后，对照组大鼠无明显变化，PPT 组大鼠在第 3 天出现前肢瘀斑、口鼻周围血迹等症状，第 4 天面部和爪子均出现瘀斑，体重显著下降，步态评分显示运动能力明显受损，尽管肺器官指数有增加趋势，但差异无统计学意义。
- PPT 诱导肺毒性的 AOE：PPT 组支气管肺泡灌洗液中 ALP、ALB、LDH 和 TP 水平显著升高；肺组织中 IL-1β、IL-6、IL-18 和 TNF-α 等促炎细胞因子显著增加，MDA 含量升高，GSH 水平也显著上升。H&E 染色显示，PPT 组肺组织出现淋巴细胞浸润、充血、肺泡壁毛细血管扩张充血以及肺泡腔内有少量红细胞等明显病理损伤。
- PPT 导致的肺微生物群紊乱（TEE1）：16S rRNA 基因测序结果显示，PPT 组肺微生物群丰富度增加，ACE、Chao 和 Sobs 指数显著高于对照组。主坐标分析（PCoA）表明 PPT 处理导致肺微生物群落结构发生显著变化。在门水平上，两组均以厚壁菌门（Firmicutes）为主，但 PPT 组放线菌门（Actinobacteria）减少，变形菌门（Proteobacteria）和拟杆菌门（Bacteroidota）相对增加；在属水平上，对照组以无色杆菌属（Achromobacter）和葡萄球菌属（Staphylococcus）为主，PPT 组中阿克曼菌属（Akkermansia）和拟杆菌属（Bacteroides）更为丰富。线性判别分析效应量（LEfSe）分析发现，两组在属水平上有 17 种微生物存在显著差异。
- PPT 导致的肠道菌群紊乱（TEE2）：对肠道内容物的 16S rRNA 基因测序显示，PPT 可能降低肠道微生物群丰富度，但多样性指数无显著变化，PCoA 显示两组肠道微生物群结构和组成存在明显差异。在门水平上，两组均以厚壁菌门为主，但 PPT 组厚壁菌门相对减少，疣微菌门（Verrucomicrobiota）、拟杆菌门和变形菌门相对增加；在属水平上，对照组以乳杆菌属（Lactobacillus）为主，PPT 组中阿克曼菌属更为丰富。LEfSe 分析发现两组在属水平上有 16 种差异微生物，其中 11 种在 PPT 组富集。
- PPT 诱导的代谢途径变化（TEE3）：GC-MS 检测结果显示，PPT 组与对照组的盲肠粪便 SCFAs 存在显著差异，PPT 组异丁酸和异戊酸浓度升高，乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、异己酸和己酸浓度显著降低。KEGG 通路分析基于差异代谢物确定了 14 条代谢途径，其中蛋白质消化吸收、碳水化合物消化吸收等途径影响较大。
- 肠道微生物群、肺微生物群、代谢物、生化标志物和炎症细胞因子之间的共现分析（TEE4）：Spearman 相关性分析构建的共现网络显示，包括肺和肠道差异微生物群、SCFA 代谢物、生化标志物和炎症因子在内的多个关键元素之间存在显著相互关系。例如，阿克曼菌属与炎症标志物 IL-6、TNF-α、IL-1β 呈正相关，还与异戊酸和异丁酸正相关；肠道拟杆菌属与 IL-18、TNF-α 和丁酸正相关。
讨论
PPT 临床应用受限主要源于其狭窄的治疗窗口和器官毒性。本研究中，PPT 组大鼠出现面部和爪子出血瘀斑、皮毛变色等全身症状，肺组织病理变化和生化标志物改变表明 PPT 可导致肺损伤、炎症反应和氧化应激。
肠道 - 肺轴在维持机体健康方面发挥重要作用，肠道微生物群紊乱可能影响肺部免疫反应和炎症调节。PPT 处理后，肺和肠道微生物群在门水平上，拟杆菌门和变形菌门相对丰度同步增加；在属水平上，阿克曼菌属、大肠杆菌 - 志贺菌属（Escherichia-Shigella）和拟杆菌属在肺和肠道中均增多。阿克曼菌属可影响肠道屏障功能，增加肠道通透性，使微生物和代谢物进入血液影响肺部；大肠杆菌 - 志贺菌属产生的内毒素能引发免疫反应，诱导肺部炎症；拟杆菌属虽能产生抗炎 SCFAs，但 PPT 处理可能破坏其平衡，导致肺部炎症加重。
SCFAs 对维持肠道和肺部健康至关重要，可调节免疫反应、维持肠道屏障功能。PPT 处理后，大鼠粪便中有益 SCFAs 减少，有害 SCFAs 增加，这可能与 PPT 介导的肺部炎症损伤和毒性有关。微生物通过代谢物调节生理功能，PPT 暴露后，肺和肠道微生物群与代谢物之间存在复杂关联，影响肺部炎症反应。
本研究揭示了 PPT 暴露、微生物群紊乱和肺毒性之间的关联，但因果关系和具体机制需进一步通过粪便微生物群移植、靶向代谢物补充等实验验证。
结论
本研究基于肠道 - 肺轴概念，全面探究了 PPT 诱导肺毒性的潜在机制。实验结果表明，PPT 可能通过破坏细胞完整性和诱导肺部氧化应激反应，导致大鼠支气管肺泡灌洗液中 TP、ALB、ALP 和 LDH 水平升高，肺组织中 MDA 和 GSH 水平改变。PPT 还破坏肠道微生物群稳态，影响其代谢物含量，导致肺部稳态失衡，使机体易患或加重肺损伤。尤其是结肠内容物和肺组织中阿克曼菌属、大肠杆菌 - 志贺菌属和拟杆菌属同时增加，可能通过影响 SCFAs 代谢（如异丁酸和异戊酸增加）和其他炎症介质（如 IL-18、TNF-α、IL-6 和 IL-1β）产生，进一步引发肺部炎症反应和损伤。这些结果表明，PPT 暴露与炎症和肺毒性相关，可能与特定细菌类群的富集有关。本研究为 PPT 诱导肺毒性的早期干预提供了新的理论视角，确定了潜在的细菌或代谢物靶点，加深了对 PPT 毒理学机制的理解，为进一步探索减轻其毒性、提高疗效的策略提供了理论指导。
