揭秘中国北京儿童急性胃肠炎中人类博卡病毒：流行特征、基因演变与防控意义

这篇研究聚焦中国北京 2014 - 2023 年儿童急性胃肠炎中人类博卡病毒（HBoVs）。发现 HBoV2 是优势基因型，6 - 24 个月儿童易感，且 HBoV2 存在新重组事件。研究首次估算 HBoV2 进化速率，为防控儿童急性胃肠炎提供关键数据。

　　

研究背景

急性胃肠炎是全球儿童发病和死亡的主要原因之一，在 5 岁以下儿童死因中排第三位。每年约有 17 亿例儿童急性胃肠炎病例，导致 443,832 名 5 岁以下儿童死亡。病毒是急性胃肠炎的主要病原体，包括轮状病毒、杯状病毒、肠道腺病毒和星状病毒等，尤其影响儿童。

人类博卡病毒 1 - 4（HBoV1 - 4）是新兴病毒，在呼吸道和粪便标本中均有检测到，HBoV1 是儿童急性呼吸道感染的病原体。然而，尽管 HBoVs 常在儿童急性胃肠炎粪便标本中被检测到，但其在急性胃肠炎中的临床意义长期存疑。

HBoV 属于细小病毒科（Parvoviridae）博卡细小病毒属（Bocaparvovirus），是一种小型、无包膜、二十面体病毒，基因组为约 5.5kb 的线性单链 DNA 分子，包含三个主要开放阅读框，编码非结构蛋白、核磷蛋白（NP1）和病毒衣壳蛋白（VP1 - VP3） 。HBoVs 具有高度多样性且频繁重组，根据 VP1 基因差异分为 4 种基因型（HBoV1 - 4），HBoV2 又可细分为 A、B、C 三个亚型。不同基因型间存在重组现象，如 HBoV3 可能由 HBoV1 与 HBoV2 和 HBoV4 的共同祖先重组形成，HBoV2C 则由 HBoV2A 和 HBoV2B 重组产生。

此前研究发现，HBoVs 在全球儿童急性胃肠炎患者粪便标本中均有检出。一项对 36 项研究的系统综述和荟萃分析表明，20,591 例急性胃肠炎患者中 HBoVs 的合并流行率为 6.9%。在中国，儿童急性胃肠炎粪便标本中 HBoVs 阳性率在 2.2% - 20.4% 之间，其中 HBoV2 的流行率和基因多样性较高，且高载量的 HBoV2 可能增加儿童患急性胃肠炎的风险。5 岁以下儿童更易感染 HBoVs，且其感染全年均可发生，在中国呈夏秋季高发的季节性特征。但中国北京地区长期以来儿童急性胃肠炎中 HBoVs 的流行和遗传特征数据有限，本研究旨在描述 2014 - 2023 年北京地区儿童急性胃肠炎患者中 HBoVs 的流行、进化和临床表现。

材料和方法

1. 临床标本：2014 年 4 月至 2023 年 12 月，从首都儿科研究所附属儿童医院急性胃肠炎门诊收集粪便标本。纳入标准为 15 岁以下儿童、每日排便 3 次及以上且持续时间小于 2 周、粪便呈液体、水样或粘液样；排除标准为慢性胃肠炎病程超过 2 周及粪便量不足以检测 HBoVs 的患者。粪便标本用磷酸盐缓冲液按 1:10 稀释，涡旋混匀后 1,500×g 离心 15 分钟，收集上清液于无菌管中，保存于 - 20°C。
2. 核酸提取：使用 QIAamp MinElute Viral Spin Kit（德国 Qiagen 公司），按照制造商说明从粪便上清液中提取核酸。
3. HBoVs 筛查和基因分型：采用引物 HBoV2 - sf2 和 HBoV2 - sr2 扩增 HBoVs NS1 基因 495 核苷酸片段，以筛查 HBoVs。从 HBoV 阳性标本中，用引物 HBoV - c1 和 HBoV - c2 扩增 NP1/VP1 边界区域 690nt 片段进行基因分型。PCR 产物经 1.5%（wt/vol）琼脂糖凝胶电泳分析，预期大小的扩增子送北京六合华大基因科技股份有限公司，用 ABI 3730xl DNA 分析仪（美国赛默飞世尔科技公司）测序。用 Chromas 软件评估原始测序数据质量，用 EditSeq 和 SeqMan 软件（DNASTAR 公司）进行序列组装和编辑，通过 BLAST 工具（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）与 NCBI GenBank 数据库中的参考菌株进行核苷酸序列比对，对高质量序列进行系统发育分析构建系统发育树。
4. HBoV2 近全长基因组扩增和测序：对 HBoV2 阳性标本，用 Zhao 等人设计的引物经桑格测序法扩增并测序近全长 HBoV2 基因组，随后进行综合系统发育分析和重组事件研究。
5. 系统发育分析：将本研究序列与 GenBank 中 HBoV1 - 4 参考序列（表 S1）一起构建系统发育树。用 MAFFT v7.520 进行多序列比对，BioAider v1.727 比较序列同一性，ModelFinder 选择合适的核苷酸替换模型。用最大似然法，1,000 次自展重复，IQ - TREE v2.2.2.6 构建系统发育树，通过在线工具 tvBOT 可视化。
6. 进化分析：用 Beast v1.10.4 中的贝叶斯马尔可夫链蒙特卡罗（MCMC）方法，推断 HBoV2 近全长基因组序列的时间分辨系统发育树和编码区进化速率。ModelFinder 选择最佳拟合模型，比较不同模型组合的贝叶斯因子确定时钟模型和树先验的最佳组合（表 S3）。MCMC 链运行至少 100,000,000 次迭代，每 10,000 代采样一次。用 Tracer v1.7.2 检查有效样本量评估收敛性，舍弃前 10% 作为老化期，有效样本量大于 200 才有效。用 95% 最高后验密度（HPD）区间量化进化速率估计的不确定性。用 TreeAnnotator v1.10.4 生成最大分支可信度（MCC）树，10% 老化期后得出共同祖先高度，用 FigTree v1.4.4 可视化树。
7. 重组分析：用重组检测程序 5（RDP5），结合 RDP、GENECONV、Chimaera、MaxChi、Bootscan、SiScan 和 3Seq 七种方法，阈值 P 值设为 0.05 检测重组事件。至少三种方法检测到的重组事件才有效。用 Simplot 软件，200bp 滑动窗口、20bp 步长进行相似性和 bootscanning 分析，进一步验证疑似重组序列。通过构建重组位点侧翼基因序列的系统发育树验证重组。
8. 选择压力分析：通过 Datamonkey 在线平台（http://www.datamonkey.org/），用非同义替换（dN）与同义替换（dS）的比率（ω）评估位点选择压力，采用单似然祖先计数（SLAC）、固定效应似然（FEL）、进化混合效应模型（MEME）和快速无约束贝叶斯近似（FUBAR）算法。ω = 1 表示中性进化，ω <1 表示负选择，ω> 1 表示正选择。评估 HBoV2 的 NS1、NP1 和 VP1 基因中潜在的正选择位点（PSS）和负选择位点（NSS），至少两种算法显示 SLAC、FEL 和 MEME 的 P 值小于 0.05，FUBAR 的贝叶斯因子或后验概率大于 0.95 的位点为正选择位点。
9. 统计分析：收集 HBoVs 阳性患儿的基本临床数据，用 SPSS 25.0 软件分析。用 Shapiro - Wilk 检验评估变量分布，正态近似法或 Clopper - Pearson 法计算检测率的 95% 置信区间（95% CIs），用中位数和四分位数间距（IQR）描述年龄相关患者特征，卡方检验评估不同性别和年龄组 HBoVs 阳性率的差异，P < 0.05 为差异有统计学意义。

结果

1. HBoVs 的流行情况：本研究共收集 3,116 份儿童急性胃肠炎粪便标本，男女比例为 1.60:1，中位年龄 0.83 岁（IQR: 0.43 - 1.67）。79 份标本（2.5%，79/3,116，95% CI: 2.0% - 3.1%）HBoVs 阳性，男女阳性率分别为 2.4%（46/1,919，95% CI: 1.7% - 3.1%）和 2.8%（33/1,197，95% CI: 1.8% - 3.7%），差异无统计学意义（χ² = 0.39，P = 0.53）。2014 年阳性率最高（3.8%，19/506，95% CI: 2.1% - 5.4%），2022 年最低（0.6%，1/179，95% CI: 0% - 3.1%）。2014 - 2017 年 HBoVs 无明显季节性流行，2018 - 2021 年 8 - 12 月阳性率较高。6 - 24 个月年龄组阳性率最高（3.2%，52/1,591，95% CI: 2.4% - 4.1%），≥60 个月年龄组阳性率最低（χ² = 4.71，P = 0.03；χ² = 4.48，P = 0.03）。
2. HBoVs 的基因分型：79 份 HBoVs 阳性标本的 NP1/VP1 边界区域序列聚类为三组，HBoV1 有 20 份（25.3%，20/79，95% CI: 15.7% - 34.9%），HBoV2 有 52 份（65.8%，52/79，95% CI: 55.4% - 76.3%），HBoV3 有 7 份（8.9%，7/79，95% CI: 2.6% - 15.1%）。HBoV2 在全年均占优势，尤其在 8 月（4.1%，12/291，95% CI: 1.8% - 6.4%）、10 月（3.6%，8/222，95% CI: 1.2% - 6.1%）和 11 月（2.8%，9/320，95% CI: 1.0% - 4.6%）；HBoV1 在 7 月（2.1%，7/329，95% CI: 0.6% - 3.7%）和 11 月（1.3%，4/320，95% CI: 0.3% - 3.2%）更常见；HBoV3 全年阳性率低，8 月（0.7%，2/291，95% CI: 0.1% - 2.5%）和 11 月（0.6%，2/320，95% CI: 0.1% - 2.2%）相对较高。HBoV2 在四个年龄组均有检出，占比 61.5% - 100%；HBoV1 在≥60 个月儿童中未检出；HBoV3 仅在 < 24 个月儿童中检出。系统发育分析纳入 63 条高质量且完整的 NP1/VP1 边界区域序列，19 条聚类为 HBoV1，37 条为 HBoV2，7 条为 HBoV3。
3. HBoV2 近全长基因组的系统发育分析：37 份 HBoV2 阳性且 NP1/VP1 边界区域序列高质量的标本中，15 份成功扩增出近全长 HBoV2 基因组序列并提交 GenBank（登录号 PQ728256 - PQ728270），12 份为部分基因组序列，10 份标本量不足。15 条近全长基因组序列聚类为两组，2 条（FB1682 - HBoV2 - China - 2017 和 FB1686 - HBoV2 - China - 2017）属于 HBoV2A，与参考序列同一性为 96.9% - 99.9%；13 条属于 HBoV2C，与中国参考序列同一性为 98.5% - 99.8%。NS1、NP1 和 VP1 编码区系统发育树显示，HBoV2C 在 NS1 和 NP1 基因树中更接近 HBoV2B，在 VP1 基因树中更接近 HBoV2A。如 FB1682 - HBoV2 - China - 2017 在 NS1、NP1 基因树中属于 HBoV2A，在 VP1 基因树中属于 HBoV2C；FB1686 - HBoV2 - China - 2017 在 NS1 基因树中属于 HBoV2B，在 NP1 和 VP1 基因树中属于 HBoV2A，这些结果提示存在重组事件。

用 MCMC 方法构建 15 条近全长和参考 HBoV2 序列的 MCC 树，本研究中 HBoV2 近全长序列的进化替换率估计为 1.4×10^?4 替换 / 位点 / 年（95% HPD 范围: 3.5×10^?5 - 2.7×10^?4），最近共同祖先时间（tMRCA）为 1845 年，之后约 1900 年分化出 HBoV2A，平均进化速率为 2.0×10^?4 替换 / 位点 / 年（95% HPD: 3.8×10^?7 - 4.4×10^?4）。HBoV2B 和 HBoV2C 的 tMRCA 分别追溯到 1988 年和 1953 年，HBoV2C 的进化速率为 1.4×10^?4 替换 / 位点 / 年（95% HPD: 8.6×10^?9 - 3.0×10^?4），表明 HBoV2C 进化速率低于 HBoV2A。HBoV2 的 NS1、NP1、VP1 和 VP3 基因进化速率分别为 1.3×10^?4（95% HPD: 5.2×10^?5 - 1.9×10^?4）、2.4×10^?4（95% HPD: 2.5×10^?6 - 4.8×10^?4）、1.5×10^?4（95% HPD: 3.9×10^?5 - 2.6×10^?4）和 1.8×10^?4（95% HPD: 3.1×10^?5 - 3.6×10^?4）替换 / 位点 / 年，NP1 基因进化速率最高，NS1 基因最低。
4. HBoV2 的重组分析：用 RDP5 和 Simplot 软件分析发现，本研究中所有 HBoV2C 序列均为 HBoV2B 和 HBoV2A 的重组体。如 FB1682 - HBoV2 - China - 2017，主要潜在亲本为 FJ170280 - HBoV2A，核苷酸同一性 99.0%，次要潜在亲本为 JX257046 - HBoV2C，同一性 97.5%，重组断点位于 4,218nt，对应 VP3 基因区域，经 Simplot 软件 bootscanning 分析和系统发育树构建证实。FB1686 - HBoV2 - China - 2017，主要潜在亲本为 FJ170280 - HBoV2A，同一性 97.4%，次要潜在亲本为 FJ973560 - HBoV2B，同一性 96.7%，重组断点位于 1,935nt、4,000nt 和 4,487nt，对应 NS1 和 VP3 基因区域，也经相关分析证实。考虑 HBoV2 的基因型内重组事件，重新估计非重组片段和 HBoV2 近全长基因组的进化速率，