反刍时间关联微生物组：奶牛低甲烷排放表型筛选的新策略

本文研究发现奶牛反刍时间（RT）与肠道微生物组、甲烷产量相关。高 RT 奶牛甲烷排放低 26%，其微生物和代谢存在差异。RT 可作为非侵入性筛选工具，助力减少奶牛肠道甲烷排放（EMEs），推动气候智能型畜牧业发展。

　　

研究背景

奶牛肠道甲烷排放（EMEs）对环境和畜牧业效率均有负面影响，其占全球甲烷排放总量的 15.4%，占农业甲烷排放的 54%，在奶牛的温室气体排放中占比达 30%。奶牛在消化过程中会因甲烷排放损失 2%-12% 的消耗总能量，降低生产效率。而且，自工业革命前以来，大气中 CH₄浓度已增加 162%，加剧了全球变暖。因此，减少奶牛的甲烷排放至关重要。

研究发现瘤胃微生物组与动物表型存在关联，不同饲料效率、剩余采食量（RFI）和甲烷排放潜力的动物，其细菌谱不同。但收集和分析瘤胃样本成本高且操作困难，所以寻找替代表型标记很关键。反刍时间（RT）可通过可穿戴设备连续监测，是一种潜在的行为特征，且具有中等遗传性，与甲烷排放相关，或可用于识别低甲烷排放动物。本研究旨在探究 RT 与甲烷产量之间的关系是否由瘤胃微生物组介导，以及瘤胃、食团和粪便样本的微生物谱能否辅助识别低甲烷排放动物。

材料与方法

本研究经宾夕法尼亚大学机构动物护理和使用委员会批准，于 2022 年 8 月 8 日开始，9 月 24 日结束。实验选取 49 头处于泌乳早期至中期（产奶 150 天内）的荷斯坦奶牛，基于 RT 从中挑选 20 头分为 “低反刍”（LR）和 “高反刍”（HR）两组，每组 10 头。

实验前，奶牛需在个体食槽进食 2 周，再适应 GreenFeed 系统 2 周。之后在实验第 5 周，于喂食后 0h、2h、8h 和 14h 对奶牛进行采样。利用 AfiCollars 监测奶牛的反刍和进食行为，通过 GreenFeed 系统测量奶牛的肠道气体排放（CO₂、CH₄和 H₂）。同时收集瘤胃、食团和粪便样本，瘤胃样本采用胃管法收集，食团样本从反刍时的牛嘴获取，粪便样本经直肠采集。

对采集的样本进行 DNA 提取、PCR 扩增、测序、文库制备和宏基因组分析。DNA 提取采用 “重复珠击加柱”（RBB + C）方法结合 QIAmp Fast DNA Stool Mini Kit 进行纯化。扩增细菌 16S rRNA 基因的 V1 - V2 区域，经测序后，用 QIIME2 处理 16S rRNA 测序数据，进行生物信息学分析。宏基因组测序数据则经质量过滤、去除宿主基因组序列等处理后进行分类学分析和功能基因、通路分析。

使用 SAS 统计软件的 PROC MIXED 程序分析动物反应变量，微生物组数据在 R 软件中分析。通过混合线性模型评估多样性指标、分类学数据和功能基因等，用 PERMANOVA 分析 β 多样性，用 Spearman 相关性探索挥发性脂肪酸（VFAs）与细菌种群关系，用广义相加模型分析 LR 和 HR 组反刍和进食时间差异。

研究结果

1. 气体排放、行为和生产效率差异：HR 奶牛日平均 EME（404 ± 6.04 g / 天）显著低于 LR 奶牛（430 ± 6.27 g / 天） 。HR 奶牛的 CO₂排放量（15,498 ± 194 g / 天）显著高于 LR 奶牛（14,252 ± 202 g / 天） ，H₂排放量略低。在生产效率方面，HR 奶牛的 CH₄效率（17.1 ± 0.64 g CH₄/kg DMI）和强度（10.3 ± 0.30 g CH₄/kg 牛奶）显著低于 LR 奶牛（23.6 ± 0.64 和 13.9 ± 0.30） 。HR 奶牛的干物质采食量（DMI，24.6 ± 0.28 kg / 天）和产奶量（MY，40.6 ± 0.47 kg / 天）高于 LR 奶牛（20.9 ± 0.28 和 35.1 ± 0.47）。HR 奶牛每天反刍时间（494 ± 31.6 min）和进食时间（261 ± 15.9 min）均显著长于 LR 奶牛（400 ± 24.4 min 和 175 ± 10.7 min）。
2. 测序信息：共产生 13,375,332 条原始配对读数，获得 7,321,872 个扩增子序列变体（ASV），涉及 24 个不同门，369 个属类别。宏基因组测序产生 1,992,813,754 条序列，质量过滤后得到 1,708,446,278 条高质量读数，约 95% 序列属于细菌，5% 属于古菌。
3. 产甲烷菌多样性及途径差异：瘤胃样本的古菌物种多样性最高，食团样本与瘤胃样本的产甲烷菌多样性相似，粪便样本与前两者的产甲烷菌群落组成存在差异。在不同样本类型中，优势产甲烷菌种类相似，但相对丰度有差异。如在瘤胃样本中，LR 奶牛的 M. YE315 相对丰度较高，而 HR 奶牛的 Methanosphaera ISO3 - F5 和 Methanosphaera stadtmanae 相对丰度较高。在粪便样本中，LR 奶牛的 M. YE315 相对丰度高于 HR 奶牛；在食团样本中，LR 奶牛的 Methanosphaera ISO3 - F5 和 Methanosphaera stadtmanae 相对丰度低于 HR 奶牛。在瘤胃样本中，HR 奶牛参与甲醇利用途径的基因拷贝数更高，食团样本与瘤胃样本的产甲烷途径基因拷贝数相似，粪便样本的相关基因拷贝数高于前两者。
4. 关键酶的差异：编码甲基辅酶 M 还原酶（MCR，EC: 2.8.4.1）的基因拷贝数在 LR 和 HR 奶牛的瘤胃、食团和粪便样本中无显著差异，但编码四氢甲烷蝶呤 S - 甲基转移酶（MTR，EC: 7.2.1.4）的基因拷贝数在瘤胃和食团样本中有约 10% 的差异。
5. 氢气利用途径差异：瘤胃中主要的 H₂消耗途径是产甲烷作用，但 HR 奶牛的 mcrA 基因拷贝数略低于 LR 奶牛，而其参与硫酸盐还原酶（dsrAB）、富马酸还原酶（frdABCD）、硝酸盐还原酶（napA）和生成氨的亚硝酸盐还原酶（nirS）等替代 H₂利用途径的基因拷贝数更高。食团样本也呈现类似趋势，粪便样本中乙酰辅酶 A 合成酶基因拷贝数较高，除 mcrA 和富马酸还原酶外，其他替代途径基因拷贝数较低。
6. 细菌群落差异：瘤胃和食团样本的细菌群落物种丰富度和多样性相似，粪便样本则与之不同。在不同样本类型中，组和采样时间对细菌群落组成均有显著影响，但组 × 采样时间的交互作用不显著。在瘤胃样本中，部分细菌类群在组和采样时间上存在显著差异，如 Bacteroidetes BF311、Firmicutes Moryella 等。食团和粪便样本中的细菌群落也受组和采样时间影响。
7. 挥发性脂肪酸（VFAs）与细菌群落的关系：LR 和 HR 奶牛的总 VFAs 和个体 VFAs 浓度在组间和采样时间上存在显著差异。LR 奶牛的乙酸摩尔比例显著高于 HR 奶牛，而 HR 奶牛的丙酸、异戊酸和戊酸摩尔比例更高。Spearman 相关性分析表明，细菌群落与个体 VFAs 的摩尔比例相关，且与 RT 表型相关。
8. 丙酸和乙酸途径相关基因差异：HR 奶牛瘤胃中丙酸水平较高，对其瘤胃、食团和粪便样本的宏基因组分析发现，HR 奶牛中参与丙酸途径的酶基因拷贝数在不同采样时间和组间存在显著差异，表明丙酸途径在 HR 奶牛中更丰富，而 LR 奶牛的乙酸途径上调。

讨论

本研究首次报道了不同反刍表型与瘤胃微生物组之间的联系，发现 RT、微生物组和 VFAs 相互关联，RT 可作为识别低甲烷排放奶牛的有效指标。此前研究已证实甲烷产量表型与瘤胃微生物组相关，低甲烷排放表型的奶牛或羊，其产甲烷菌群落中甲醇利用型 Methanosphaera 的比例更高，本研究结果与之相符。

与之前研究不同，本研究发现 HR 奶牛瘤胃样本中参与替代 H₂利用途径的基因拷贝数增加，表明高 RT 有助于瘤胃中 H₂更有效地分配到替代途径，减少用于产甲烷的 H₂。此外，HR 奶牛的丙酸水平较高，且与丙酸生成相关的细菌增多，这与低甲烷排放表型奶牛的特征相似，进一步证明 RT 可作为甲烷产量表型的良好替代指标。

在本研究中，食团和粪便样本的微生物谱和产甲烷菌多样性与瘤胃样本具有一致性，可作为瘤胃样本的替代，用于识别低甲烷排放潜力的动物。但采集食团样本时需注意在奶牛反刍时进行，以确保样本代表性。粪便样本富含 Firmicutes，其革兰氏阴性菌种群相对较低，但 Firmicutes 和产甲烷菌多样性与瘤胃、食团样本相似。

结论

本研究表明 RT 可作为与微生物组相关的非侵入性策略，用于识别低 EME 奶牛。高 RT 奶牛具有与甲基营养型产甲烷和替代氢消耗相关的基因丰度增加，以及快速发酵、产丙酸细菌富集的特点。这意味着宿主基因型可影响反刍模式，进而影响细菌 - 产甲烷菌相互作用，提高发酵效率，减少甲烷生成。此外，食团和粪便微生物组的日波动表明，它们可作为瘤胃微生物组的替代，用于甲烷减排策略。以 RT 为选择标准，有望为提高奶牛生产效率和减少甲烷排放提供一种可扩展且经济有效的方法，将反刍行为等生理特征与细菌 - 古菌网络相结合，有助于深入理解基因组 - 表型相互作用，更有效地识别甲烷减排表型。