生物膜结构如何左右结合性质粒传播？—— 解析抗生素耐药性扩散关键机制

本文聚焦细菌结合性质粒传播，通过实验揭示生物膜结构对其影响。研究发现，二维细胞单层中质粒水平转移占主导；三维生物膜中，成熟度、细胞密度和结构影响质粒传播。这为控制抗生素耐药性扩散提供重要依据。

　　

研究背景

在自然和临床环境中，细菌常形成生物膜（biofilm）。生物膜是表面附着、具空间结构且嵌入自身产生的聚合胞外基质的细菌群落。与浮游细胞相比，三维生物膜中的细菌对抗生素和噬菌体感染耐受性更强。同时，生物膜在抗生素耐药性传播方面可能发挥重要作用，因结合作用受细菌细胞密度影响，而生物膜中细胞高度密集，故推测结合性质粒转移可促进抗生素耐药基因在生物膜中传播。但此前研究存在方法和实验条件限制，难以直接验证该假设，且多聚焦群体层面分析，缺乏单细胞层面的实时定量研究。

研究方法

1. 细菌菌株、质粒和生长条件：研究中使用的细菌菌株、质粒和引物分别列于补充材料的相关表格。通过 λRed 重组技术对 RP4 质粒进行基因插入和替换，利用 pKO3 质粒进行染色体基因敲除，采用 Gibson Assembly 进行质粒克隆，并用 Sanger 测序验证菌株和质粒。细菌在不同培养基中生长，根据需要添加抗生素。
2. 活细胞显微镜实验
   • 细胞单层实验：在细胞单层中可视化结合性 RP4 质粒转移时，将过夜培养的供体和受体细胞分别在 LB 培养基中 37°C 振荡培养，稀释后继续培养至特定 OD₆₀₀值，混合后加载到准二维微流控芯片中，在 37°C、无新鲜培养基流动条件下每隔 10 分钟成像 3 小时。观察 ssDNA 质粒转移和 ss - dsDNA 转换时间时，细胞培养条件类似，但在受体细胞培养时添加 IPTG 诱导 mcherry - parB 基因表达，且每隔 1 分钟成像 2 小时。
   • 生物膜实验：受体细胞过夜培养后稀释接种到微流控装置中，在特定条件下培养不同时间形成生物膜。供体细胞过夜培养后稀释培养至特定 OD₆₀₀值，将其悬浮液流入含受体生物膜的微流控通道中共同孵育 4 小时，之后换为无菌培养基继续培养，每隔 2 小时成像 20 小时，成像在特定显微镜下进行。
   
   
3. 图像分析
   • 细胞单层图像分析：利用 Fiji 软件和 MicrobeJ 插件对细胞单层图像进行定量分析，通过手动计数不同细胞的荧光来确定供体、受体和转导子细胞数量，根据特定荧光事件计算滞后时间等参数。
   • 生物膜图像分析：使用 BiofilmQ 软件对生物膜图像进行分析，通过对不同荧光信号的分割确定受体、供体细胞的生物体积，根据荧光通道重叠识别转导子细胞并计算其频率，同时计算生物膜表面覆盖率。
   
   

研究结果

1. 细胞间 RP4 质粒转移动态：在准二维微流控芯片中培养的大肠杆菌细胞单层上，利用实时荧光显微镜监测 RP4 质粒转移过程。通过特定遗传报告系统，可观察到单链 DNA（ssDNA）质粒转移和转换为双链 DNA（dsDNA）的过程。研究发现，ssDNA 转移至受体细胞的时间约为 1.8 ± 0.8 分钟，据此估算转移速率为 556 ± 267 nt/s，与 F 质粒转移速率相近。98% 的质粒转移事件中，供体和转导子细胞中 Ssb - Ypet 结合性焦点同时出现，且两者 Ssb - Ypet 焦点寿命相近。此外，ss - dsDNA 转换所需时间为 1.4 ± 0.7 分钟，部分转导子细胞中 Ssb - Ypet 焦点和 mCherry - ParB 焦点会共定位一段时间，表明互补链合成在 ssDNA 转移完成前已启动。
2. RP4 质粒在高密度二维细菌群体中的传播：构建荧光报告系统，将携带 P_biofab - sfGFP 荧光报告基因的 RP4 质粒导入供体细胞，受体细胞表达 mRuby2 荧光蛋白，转导子细胞因同时表达两种荧光蛋白而呈黄色。实验中以 1:10 比例混合供体和受体细胞接种细胞单层，100 分钟后，98% ± 2% 的供体与至少一个转导子细胞接触，92 ± 2 % 的受体在接触供体细胞后 20 分钟内转化为转导子。通过测量细胞群体平均分裂时间发现，新产生的转导子细胞分裂时间略长。理论计算和实验数据对比表明，RP4 质粒在细胞单层中的传播主要通过水平转移，且新产生的转导子细胞向受体细胞的二次转移在质粒传播中起重要作用。
3. RP4 质粒在不同发育阶段三维生物膜中的传播：在高度为 100 μm 的微流控芯片中接种供体和受体菌株，构建三维生物膜，利用共聚焦显微镜和 BiofilmQ 软件观察质粒传播。当同时接种供体和受体细胞时，生物膜生长 12 小时后转导子频率为 57 ± 11 % 。当用不同成熟阶段的受体生物膜接触供体细胞时，发现 12 小时和 24 小时的生物膜在接触供体细胞 20 小时后，转导子频率分别为 56 ± 28 % 和 3.5 ± 3.5 %，24 小时以上的生物膜转导子频率极低。这表明成熟度较高的生物膜对质粒转移有抗性，且受体生物膜表面覆盖率与转导子频率相关，较老的生物膜形成厚 “草坪” 结构，覆盖大部分芯片表面，不利于质粒转移。
4. RP4 质粒在不同基质组成三维生物膜中的传播：受生物膜对噬菌体耐受性机制启发，研究细胞外基质成分对 RP4 - sfGFP 质粒转移的影响。使用缺失不同基质成分的受体突变菌株构建生物膜，发现缺乏鞭毛（?fliC 和?flhDC 菌株）的生物膜转导子频率显著高于野生型生物膜，而缺乏其他基质成分的生物膜与野生型抗性相似。进一步研究发现，鞭毛缺陷型生物膜表面覆盖率较低，存在未定植间隙，供体细胞可附着于此，从而促进质粒转移。
5. 质粒在野生型和鞭毛缺陷型三维生物膜中的传播机制：通过量化供体、受体和转导子细胞的空间分布发现，供体细胞附着位置影响质粒传播。在野生型生物膜中，供体细胞附着于底部玻璃表面，随受体生物膜扩展被纳入，可促进质粒传播；而附着于生物膜顶部则产生较少转导子。鞭毛缺陷型生物膜中，供体细胞可在不同高度附着，底部附着时转导子丰度更高，表明鞭毛在生物膜基质中不抑制结合作用，而是生物膜间的空隙促进了质粒转移。
6. 三维生物膜中细胞密度对质粒传播的影响：观察发现生物膜顶部和底部细胞密度不同，顶部细胞密度低，供体细胞在此处产生的转导子少；底部细胞密度高，转导子多。构建 csgD * 突变株生物膜，其细胞密度高，供体细胞无论附着在顶部还是底部，都能产生大量转导子。这表明生物膜内细胞密度是结合成功的关键决定因素，野生型生物膜底部靠近基质表面细胞密度足够高，有利于质粒传播。

研究讨论

1. 质粒转移动力学：单细胞分析表明，转移质粒大小与转导子细胞中 Ssb - Ypet 结合性焦点寿命相关，量化该焦点停留时间可精确测量质粒转移速率。研究结果还表明，RP4 互补链合成在质粒环化之前启动，可能涉及 RP4 质粒编码的引发酶 TraC。
2. 二维群体中质粒传播：在密集的二维群体中，RP4 质粒传播主要通过水平转移，而非垂直传播。二次转移在质粒传播中占比大，且比初始供体转移更快，这可能与合子诱导有关。与其他在琼脂表面的研究不同，本研究使用微流控系统持续供应营养，促进了质粒传播，使二次转移成功发生，且所有携带 RP4 质粒的供体细胞在与受体细胞接触时都能有效转移质粒。
3. 生物膜结构对质粒传播的影响：生物膜结构限制了供体与受体细胞接触，进而影响质粒传播效率。研究未发现基质成分影响质粒传播的证据，而是细胞密度起关键作用。较老的生物膜周边细菌密度低，限制了供体与受体细胞接触，降低了供体转移质粒的能力。本研究结论特定于实验条件下的生物膜，对于其他条件下形成的生物膜可能不适用。
4. 生物膜与抗生素耐药性：总体而言，生物膜可在无选择压力下保留结合性质粒，可能成为抗生素耐药性的储存库，但在本研究条件下，生物膜不易获得耐药性。