重大发现！LGR5 与 HSP90AB1 相互作用介导前列腺癌恩杂鲁胺耐药机制揭秘

本文聚焦前列腺癌，研究发现亮氨酸重复富含 G 蛋白偶联受体 5（LGR5）与热休克蛋白 90αB1（HSP90AB1）相互作用，激活 WNT/β - catenin / 雄激素受体（AR）轴，介导恩杂鲁胺耐药。这为前列腺癌治疗提供新靶点，具有重要意义。

　　

研究背景

前列腺癌是男性常见癌症，在西方是第二大癌症死因，2024 年中国预计新增 93,549 例。雄激素剥夺疗法广泛用于治疗前列腺癌，但耐药问题突出，几乎所有患者经常规雄激素剥夺疗法（ADT）后都会进展为去势抵抗性前列腺癌（CRPC）。恩杂鲁胺是抑制雄激素受体（AR）核转位的药物，对 AR 的选择性和亲和力比比卡鲁胺高 5 - 8 倍，用于治疗 CRPC，但部分患者使用后前列腺特异性抗原（PSA）水平无变化，且最终会产生耐药性。

亮氨酸重复富含 G 蛋白偶联受体 5（LGR5）是 G 蛋白偶联受体家族的七跨膜受体之一，最初被认为是肠道干细胞的标志物，后发现它是多个器官中具有自我更新和多能性的成体干细胞群的分子标记。已有研究证实 LGR5 在肿瘤发生、增殖、耐药和侵袭过程中起重要作用，但它在前列腺癌中的作用机制以及介导恩杂鲁胺敏感性的具体机制尚不清楚。本研究旨在揭示 LGR5 介导恩杂鲁胺敏感性的潜在机制。

研究方法

1. 数据挖掘和生物信息学分析：从 GEO 数据库下载三个数据集（GSE15108、GSE150807 和 GSE183100），按不同标准筛选差异表达基因。
2. 人类组织样本：经伦理委员会批准，收集 142 对肿瘤及相邻福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织样本，其中 16 例样本缺乏临床数据。对 126 例患者的临床数据进行分析，随访频率为每 2 年一次，采用电话随访，失访率为 35.7%，最终 92 例患者有随访信息。样本由两名独立病理学家鉴定分析，根据指南确定 TNM 分期和 Gleason 评分。
3. 免疫组织化学（IHC）染色和评分分析：按已报道方法进行染色测试，用抗 LGR5 抗体检测标本中 LGR5 的表达，由两名病理学家对 LGR5 表达进行评分，通过显微镜和相关软件获取及处理 IHC 图像。
4. 细胞培养：购买多种前列腺癌细胞系，在含 10% 胎牛血清和 1% 青霉素 / 链霉素的 RPMI - 1640 培养基中，于 37°C、5% CO₂的恒温恒湿环境下培养。
5. 伤口愈合实验：细胞在 6 孔板中培养至完全汇合，用灭菌移液器尖端划痕，更换含 1% 胎牛血清的培养基，每隔 12 小时拍照。
6. 迁移和侵袭实验：使用 8 - μm 孔小室和 24 孔 Transwell 板评估前列腺癌细胞的迁移和侵袭能力。
7. 细胞增殖实验：通过 Cell Counting Kit - 8（CCK - 8）和集落形成实验检测细胞活力。
8. RNA 分离和定量逆转录聚合酶链反应（qRT - PCR）：按试剂盒说明提取总 RNA，使用相关试剂盒和仪器检测基因的 mRNA 表达水平，引物信息在补充表 3 中。
9. 瞬时转染和慢病毒构建：获取多种小干扰 RNA（siRNA），按说明进行转染。将全长 LGR5 克隆到载体中，进行慢病毒生产和感染。
10. 核和细胞质蛋白提取：用核质提取试剂盒分离细胞质和核蛋白，通过 SDS - PAGE 和 Western blotting 分析检测相关蛋白。
11. Western blotting：按已报道方法进行 Western blotting 分析，使用多种一抗，用增强化学发光试剂盒进行可视化。
12. 异种移植实验：经动物伦理委员会批准，使用 3 - 4 周龄 BALB/C 雄性裸鼠，在特定条件下饲养和实验。
13. 免疫共沉淀（Co - IP）实验：按试剂盒说明进行 LGR5 和 HSP90AB1 的 Co - IP 实验，最后进行 Western blotting 分析。
14. 免疫荧光：细胞在共聚焦培养皿中培养后固定、封闭，加一抗孵育过夜，洗涤后加二抗染色，用 DAPI 染色，用共聚焦激光扫描显微镜拍照。
15. GST pull - down 实验：将 LGR5 全长序列克隆到含 GST 标签的载体中，转染大肠杆菌，诱导蛋白表达和纯化。将纯化的 GST - LGR5 蛋白与癌细胞蛋白上清混合孵育，分离蛋白并染色，分析差异蛋白条带。
16. 统计分析：用 Student’s t 检验评估定量结果，用 Pearson χ²检验分析临床变量，用 Kaplan - Meier 法描述患者生存预后，P < 0.05 为差异有统计学意义。

研究结果

1. LGR5 表达与恩杂鲁胺敏感性及预后不良相关：通过对恩杂鲁胺耐药前列腺癌细胞的测序数据筛选，发现 LGR5 可能是影响前列腺癌对恩杂鲁胺治疗敏感性的关键基因。在恩杂鲁胺耐药细胞系、治疗前后的前列腺癌测序数据中，LGR5 表达均显著增加。在临床组织样本中，肿瘤组织中 LGR5 表达高于相邻组织，且与 Gleason 评分和预后相关，但与年龄和 TNM 分期无关。前列腺癌细胞系中 LGR5 表达也显著高于正常细胞系。
2. LGR5 促进前列腺癌的恶性进展：在 22Rv1 和 C4 - 2 细胞中分别沉默和过表达 LGR5，验证效率后进行功能实验。结果显示，沉默 LGR5 抑制肿瘤细胞的迁移、侵袭和增殖，而过表达 LGR5 则促进这些过程。
3. LGR5 降低前列腺癌细胞对恩杂鲁胺的敏感性：CCK - 8 实验表明，过表达 LGR5 的细胞对恩杂鲁胺的敏感性降低。凋亡实验证实，沉默 LGR5 增强 22Rv1 和 C4 - 2 细胞对恩杂鲁胺的敏感性，使细胞凋亡百分比增加，相关凋亡蛋白水平也增加；过表达 LGR5 则相反。体内实验显示，上调 LGR5 促进前列腺癌细胞在体内生长，并增强肿瘤对恩杂鲁胺的耐药性。
4. LGR5 通过与 HSP90AB1 结合调节 WNT/β - catenin/AR 轴：GST pull - down 和质谱分析鉴定出 HSP90AB1 是与 LGR5 相互作用的蛋白，Co - IP 实验、免疫荧光分析进一步验证了它们的相互作用。基因集富集分析发现，恩杂鲁胺耐药细胞系中 WNT/β - catenin 信号通路显著上调。LGR5 与 HSP90AB1 结合促进 GSK - 3β 磷酸化，导致 β - catenin 在细胞质中积累并进入细胞核，激活 WNT 信号通路。同时，LGR5 还调节 AR 的表达和定位，促进 AR 蛋白在细胞核中的增加，且 AR 与 β - catenin 在细胞核中相互作用，表明 LGR5 促进 WNT/β - catenin/AR 信号通路的激活。
5. LGR5 介导的恩杂鲁胺敏感性可通过敲低 HSP90AB1 恢复：在 22Rv1 和 C4 - 2 细胞中敲低 HSP90AB1，验证敲低效率后进行挽救实验。结果显示，敲低 HSP90AB1 恢复了由 LGR5 过表达导致的 WNT/β - catenin 信号通路的变化，增加了 LGR5 过表达细胞经恩杂鲁胺处理后的凋亡比例，恢复了 LGR5 介导的对恩杂鲁胺的敏感性，相关凋亡蛋白水平也增加。

研究讨论

耐药是前列腺癌治疗中不可避免的问题，但其具体机制尚不清楚。本研究发现 LGR5 在恩杂鲁胺耐药细胞系中显著差异表达，体内外实验证实其促进前列腺癌的恶性进展和对恩杂鲁胺的耐药性，且 LGR5 在前列腺癌患者中上调，与预后不良相关。机制上，LGR5 与 HSP90AB1 结合，调节 GSK - 3β 的磷酸化水平，激活 WNT/β - catenin 通路，调节 AR 的转录和蛋白水平，从而降低前列腺癌对恩杂鲁胺的敏感性。

HSP90AB1 是新发现的 LGR5 结合蛋白，它作为分子伴侣增强 GSK - 3β 的磷酸化，在多种癌症中促进肿瘤进展。本研究还发现前列腺癌中的 LGR5 不依赖经典的干性功能，为其激活 WNT/β - catenin/AR 轴的分子机制提供了数据支持。

然而，本研究存在一些不足。通过蛋白质质谱鉴定出许多其他 LGR5 结合蛋白，但未进一步排除这些通路对前列腺癌恩杂鲁胺耐药性的影响。此外，样本量相对较小，可能限制 LGR5 作为治疗靶点的普遍性，未来需要更多样本进行验证。

总之，本研究确定 LGR5 是前列腺癌的癌基因，其高表达与前列腺癌预后不良相关。LGR5 与 HSP90AB1 的结合激活 WNT/β - catenin/AR 轴，抑制前列腺癌对恩杂鲁胺治疗的敏感性。该研究为理解 LGR5 在前列腺癌进展中的作用提供了新视角，并将 LGR5 确定为前列腺癌潜在的治疗靶点。