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儿童肺炎危害大，早期诊断至关重要。miRNA 检测存在挑战，现有技术受限。研究人员开发催化发夹组装 - 触发邻近滚环转录系统检测 miRNA-21。该系统灵敏度达 0.51 fM，特异性高，为临床检测提供新方法。
肺炎是一种常见的呼吸道感染疾病，主要由细菌、病毒或真菌引起，在儿童群体中发病率极高。据估计，全球每年约有 1.5 亿儿童患上肺炎，其中 1100 - 2000 万（7 - 13%）会发展为严重肺炎，需要住院治疗，而住院病例中又有 5 - 10% 会在 30 天内死亡。面对如此严峻的形势，寻找新型的生物标志物来实现儿童肺炎的早期诊断迫在眉睫。
微小 RNA（miRNA）是一类由 Dicer 酶从茎环前体加工而来的小型非编码 RNA，长度在 18 - 25 个核苷酸之间。它们在细胞的发育、分化和凋亡等过程中发挥着关键作用，通过调控基因表达参与多种生理和病理过程。研究发现，miRNA 的表达失调与多种疾病密切相关，儿童肺炎也不例外。因此，精确检测 miRNA 的表达水平，对于疾病的诊断、病理生理研究以及治疗方案的制定都具有重要意义。
然而，检测 miRNA 并非易事。miRNA 序列短、在生物样本中含量低，并且 miRNA 家族成员之间序列相似度高，这使得 miRNA 检测面临诸多挑战。传统的检测技术，如定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）、微阵列和 Northern 印迹等，虽然被广泛应用，但都存在明显的局限性。这些技术灵敏度有限，在检测低丰度 miRNA 时可靠性不足；而且像微阵列等技术，对探针设计要求复杂，不仅增加了实验难度，还提高了成本。此外，基于比率的生物传感方法虽然能提高测量准确性，但需要双荧光团标记，导致实验复杂且成本高昂。现有基于适配体的生物传感器在检测痕量目标时，信号放大能力也不够。
为了解决这些问题，研究人员开展了一项研究。他们开发了一种由靶标触发的催化发夹组装系统，该系统与 T7 RNA 聚合酶介导的滚环转录（RCT）相结合，用于超灵敏、无标记地检测 miRNA - 21。这项研究成果发表在《Analytical Biochemistry》上，为 miRNA 检测领域带来了新的突破。
研究人员在这项研究中用到的主要关键技术方法包括：首先是催化发夹组装（CHA）技术，利用靶标 miRNA - 21 引发发夹探针的结构重排；其次是滚环转录（RCT）技术，通过该技术合成孔雀石绿（MG）结合 RNA 适配体；最后利用 MG 与适配体结合产生荧光信号的特性进行检测，整个过程无需对样本进行复杂处理和昂贵的标记操作。
研究结果
- 检测系统的原理：检测系统由精心设计的四个组件构成，分别是发夹探针 - 1（HP1）、发夹探针 - 2（HP2）、锁式探针 - 1（padlock - 1）和锁式探针 - 2（padlock - 2）。其中，每个锁式探针都包含 MG RNA 适配体转录模板的部分序列。检测过程起始于靶标 miRNA - 21 与 HP1 通过 toehold 介导的链置换结合，形成 miRNA/HP1 复合物。这一结合使得 HP1 中原本隐藏的区域暴露出来，随后该区域与 HP2 杂交。
- 检测系统的性能：该检测系统展现出了极高的灵敏度，能够检测到低至 0.51 fM 浓度的 miRNA - 21。同时，它还具有高度的特异性，能够有效区分 miRNA - 21 与单碱基错配序列，在临床样本中监测 miRNA - 21 的表达具有很大的潜力。
研究结论和讨论
研究人员成功开发了一种无标记生物传感平台，通过靶标引发的滚环转录组装 MG RNA 适配体，实现了对 miRNA - 21 的超灵敏检测。该检测机制主要依赖于三个方面：一是通过 toehold 介导的链置换特异性识别 miRNA - 21，触发催化发夹组装和靶标循环；二是形成双环形 DNA 模板，实现同时滚环转录；三是生成多个 MG 结合适配体，从而产生强大的荧光信号。
这项研究成果意义重大。它为 miRNA 检测提供了一种全新的方法，有效克服了传统检测技术的局限性。其低背景、高信噪比和超高灵敏度的特点，使其在临床诊断、疾病研究等领域具有广阔的应用前景。此外，该策略还具有很强的灵活性，通过修改靶标识别序列，有望用于检测其他痕量生物标志物，为生命科学和健康医学研究提供了有力的技术支持，推动了相关领域的进一步发展。
