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在蛋白质合成过程中，前体 mRNA 剪接异常会引发多种疾病，如颅缝早闭症（Craniosynostosis）。研究人员对 TCF12 基因剪接位点变异展开研究，鉴定出 2 个新变异和 1 个已知变异，证实其影响蛋白功能，为变异致病性分类提供依据，助力相关疾病研究。
在生命的微观世界里，基因的 “语言” 精确地指挥着细胞的每一项活动，其中前体 mRNA 剪接是生成功能性蛋白质的关键步骤。就像精密的拼图游戏，剪接过程要准确无误地去除非编码的内含子，连接编码外显子，才能拼出正确的蛋白质 “图案”。一旦这个过程出现差错，就如同拼图缺块或错拼，会产生功能异常的蛋白质，进而引发各种人类疾病，颅缝早闭症就是其中之一。
颅缝早闭症是一种先天性疾病，表现为颅骨的一条或多条颅缝过早融合。想象一下，颅骨本应像逐渐搭建的 “小房子”，颅缝是预留的 “生长缝隙”，让大脑和颅骨能协调生长。但在颅缝早闭症患者中，这些 “缝隙” 过早关闭，阻碍了大脑和颅骨的正常发育，导致患者出现颅内压升高、智力障碍、面部畸形等一系列问题。其发病率在 1/1800 - 1/2400 新生儿之间，分为非综合征型和综合征型，病因复杂，涉及多种染色体异常和至少 57 个基因的致病性变异。
TCF12 基因编码的 bHLH（basic helix - loop - helix）蛋白 TCF12（转录因子 12）与颅缝早闭症 3 型（OMIM: 615314）相关，呈现出类似 Saethre - Chotzen（OMIM:101400）的表型。然而，基因变异的世界充满未知，许多潜在的致病变异尚未被发现，已发现的变异也缺乏功能分类和实验研究。这就好比在黑暗中摸索，虽然知道基因变异与疾病有关，但不清楚它们是如何 “捣乱” 的。为了揭开这些谜团，德国 Julius - Maximilians - University 的研究人员 Angela Borst、Eva Klopocki 等人展开了深入研究，相关成果发表在《Human Genomics》上。
研究人员采用了多种关键技术方法。首先，通过对患者血液样本的 gDNA 进行下一代测序（NGS），结合生物信息学分析，筛选出潜在的变异。然后，构建突变匹配的 pSPL3b - cam 质粒进行微小基因剪接试验（minigene splice assay），在 U - 2 OS 细胞中验证变异对剪接的影响。最后，利用 Luciferase 试验检测变异对 TCF12 蛋白转录活性的影响。
研究结果
- 变异鉴定：研究人员通过外显子组测序，在 TCF12（NM_207037.2）基因中鉴定出 1 个先前描述过的和 2 个未描述过的杂合变异（c.1467 + 1G > C、c.1468–7 A > G、c.1746 - 5_1746 - 1dup），这些变异均位于已知致病基因的典型剪接位点附近，计算机预测它们可能导致 mRNA 剪接错误。
- 剪接分析：通过计算机剪接预测和体外微小基因剪接试验，对三个变异进行研究。结果显示，P1 变异导致外显子 16 的剪接供体丢失，体外实验证实其剪接产物中外显子 16 完全跳过；P2 变异产生了一个新的隐蔽剪接受体位点，同时降低了初始剪接受体位点的活性，体外实验表明其剪接产物中外显子 17 跳过；P3 变异导致外显子 19 的剪接受体位点发生改变，体外实验显示部分内含子 18 插入到剪接产物中。这些结果表明，体外实验与计算机预测在两个变异（P1 和 P3）上一致，验证了变异对剪接的影响。
- 功能分析：Luciferase 试验结果显示，与野生型 TCF12 蛋白相比，由这三个变异产生的异常蛋白的相对荧光素酶活性均显著降低。其中，部分缺失 AD2 结构域的 P1 异常蛋白活性最弱，而由于提前终止密码子导致缺失 bHLH 结构域的 P2 和 P3 异常蛋白活性虽高于 P1，但仍显著低于野生型。这表明这些变异显著影响了 TCF12 蛋白的转录功能。
研究结论与讨论
研究人员成功鉴定出两个新的和一个已知的 TCF12 基因剪接位点变异，并通过实验证明了这些变异对蛋白质功能的有害影响，将这三个变异归类为 “可能致病”。对于 P1 变异，其导致 AD2 结构域部分缺失，影响了 TCF12 蛋白的转录功能，解释了患者的双侧冠状缝早闭表型。P2 和 P3 变异导致 bHLH 结构域缺失，影响了 TCF12 蛋白的二聚化和转录激活功能，与颅缝早闭症的发生相关。
这项研究意义重大。它强调了体外功能研究对于确定剪接变异致病性的必要性，尤其是在计算机预测显示变异可能影响剪接的情况下。研究建立的方法流程，无需额外的患者来源材料，就能对潜在剪接位点变异进行功能分析，不仅适用于典型剪接位点附近的变异，也为研究预测会导致异常剪接的深内含子变异提供了可能。在基因变异分类面临挑战，如颅缝早闭症相关基因变异外显率降低导致遗传分析不确定时，该研究为解决这些问题提供了重要的参考依据，推动了对颅缝早闭症等相关疾病致病机制的深入理解，为未来的诊断和治疗奠定了基础 。
