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本文聚焦植物病毒研究，发现水稻胞外囊泡（EV）中的 Osa-miR159a.1-1 和 Osa-miR167a 可进入昆虫肠道细胞。前者通过靶向PLCβ促进水稻条纹病毒（RSV）复制，后者直接靶向 RSV 的RdRp抑制其复制，为理解植物与昆虫 - 病毒互作提供新视角。
研究背景
虫媒病毒（Arboviruses）对全球粮食安全和公共卫生构成重大威胁，约 80% 的植物病毒依赖昆虫介体传播，而虫媒传播的人类疾病在传染病中占比超 17%。与病毒和宿主间引发症状的 “军备竞赛” 不同，虫媒病毒在昆虫介体中维持平衡，确保介体存活和病毒传播。
小 RNA（sRNA）介导的 RNA 干扰（RNAi）是真核生物的固有免疫和基因调控机制，可在生物间传递，引发 “跨物种 RNAi”。细胞外囊泡（EV）介导的 sRNA 运输在细胞间和物种间通讯中起重要作用，然而植物 EV 介导的跨物种 RNAi 在昆虫介体中对病毒感染的调控作用尚不清楚。
水稻条纹病毒（RSV）是一种严重危害水稻生产的植物病毒，由灰飞虱（Laodelphax striatellus）以持久增殖方式传播。本研究旨在探究植物 EV 介导的 sRNA 运输如何调节 RSV 在昆虫介体中的复制。
研究结果
- 水稻 EV 中包裹的 miRNA：研究人员通过差速超速离心法从水稻叶片质外体流体中分离出 EV，这些 EV 在透射电镜下呈杯状或圆形蛋糕状结构。纳米颗粒跟踪分析（NTA）显示，RSV 感染和健康水稻的 EV 浓度和大小相似。喂食标记的水稻 EV 后，在灰飞虱中肠上皮细胞的细胞质中观察到红色荧光信号，证实了灰飞虱对水稻 EV 的摄取。
对健康和 RSV 感染水稻的 EV 进行 sRNA 测序，共鉴定出 91 种水稻来源的 miRNA（Osa-miRNAs），其中 8 个 miRNA 家族在水稻和水稻 EV 中高度表达，表明高丰度的 Osa-miRNAs 优先被包裹在 EV 中。对带毒灰飞虱的 sRNA 测序发现，23 种 Osa-miRNAs 可从水稻 EV 转移到昆虫细胞。
2. 通过 EV 传递到昆虫细胞的水稻 miRNA：从六个水稻 miRNA 家族中各选一个丰度较高的 Osa-miRNA 进行验证，RT-PCR 分析表明，Osa-miR159a.1-1、Osa-miR166a、Osa-miR167a 和 Osa-miR396c 在纯化的水稻 EV 和喂食 5% 蔗糖 3 天的灰飞虱中肠中均被检测到，而 Osa-miR164a 和 Osa-miR162a 仅在纯化的水稻 EV 中被检测到。酶降解实验显示，Osa-miR166a 和 Osa-miR167a 可能以游离形式存在，而 Osa-miR159a.1-1 和 Osa-miR396c 可能与水稻 EV 中的蛋白质结合。
RIP-qPCR 实验表明，Osa-miR159a.1-1、Osa-miR166a 和 Osa-miR167a 与灰飞虱 AGO1 蛋白结合。FISH 实验显示，这三种 miRNA 主要定位于昆虫中肠上皮细胞的细胞质中，且在唾液腺、脂肪体和血淋巴中也有检测到。
3. 三种富含 EV 的水稻 miRNA 对灰飞虱中 RSV 复制的影响：用含水稻 EV 的 5% 蔗糖喂养带毒灰飞虱 4 天，RSV 的 RNA 水平无变化。单独应用 miRNA 激动剂（agomir）或拮抗剂（antagomir）的实验表明，Osa-miR159a.1-1 促进 RSV 复制，Osa-miR167a 抑制 RSV 复制，而 Osa-miR166a 对病毒载量无显著影响。
4. Osa-miR167a 靶向 RSV RdRp抑制病毒复制：通过生物信息学预测和双荧光素酶报告基因实验，发现 Osa-miR167a 可直接靶向 RSV 的RdRp。RIP-qPCR 实验进一步证实了 Osa-miR167a 与RdRp的结合。注射 Osa-miR167a 激动剂可降低RdRp的表达水平，抑制 RSV 复制；注射拮抗剂则促进RdRp表达和 RSV 复制。
5. Osa-miR159a.1-1 靶向PLCβ增强灰飞虱中 mRNA 稳定性：预测并验证了 Osa-miR159a.1-1 的靶基因之一为PLCβ。双荧光素酶报告基因实验和 RIP-qPCR 实验证实了 Osa-miR159a.1-1 与PLCβ的直接相互作用。FISH 实验显示，Osa-miR159a.1-1 和PLCβ mRNA 在中肠上皮细胞的细胞质中共定位。RNA 衰减实验表明，Osa-miR159a.1-1 通过增强 mRNA 稳定性正向调节PLCβ表达。
6. PLCβ通过CSL介导的细胞凋亡抑制促进病毒复制：敲低PLCβ的表达可降低 RSV 的 RNA 水平。转录组测序和 qPCR 分析发现，CSL是PLCβ下游的重要基因，敲低CSL可减少病毒载量。TUNEL 实验表明，CSL负调控灰飞虱的细胞凋亡，PLCβ通过诱导CSL表达抑制细胞凋亡，从而促进病毒复制。
研究讨论
本研究成功鉴定了水稻 EV 中包裹的 miRNA，并解析了两种富含 EV 的水稻 miRNA 作为跨物种调节因子对植物虫媒病毒在昆虫介体中复制的调控功能。Osa-miR159a.1-1 和 Osa-miR167a 从水稻 EV 转移到昆虫中肠上皮细胞，分别促进和抑制 RSV 复制，这种差异调节有助于维持病毒在昆虫介体中的平衡和有效传播。
植物和动物中 miRNA 靶标识别模式的差异，使得 miRNA 在跨物种调节中发挥不同功能。例如，Osa-miR167a 在水稻中靶向Auxin response factor调节植物生长，而在灰飞虱中靶向 RSV RdRp抑制病毒复制。
多种 RNA 物种可被包裹在 EV 中，EV 保护它们免受核酸酶降解。水稻 EV 主要包含 18 - 19 和 21 nt 的 sRNA，与水稻中主要的 21 和 24 nt sRNA 不同，且高丰度的水稻 miRNA 更易被包装到 EV 中。miRNA 通过多种机制选择性地分选进入 EV，本研究中水稻 EV 可能通过内吞途径被昆虫细胞摄取。
此外，miRNA 不仅可以通过转录后沉默基因表达，还能上调基因表达。Osa-miR159a.1-1 通过增强 mRNA 稳定性上调PLCβ表达，推测其可能与PLCβ 5'UTR的二级结构相互作用。
磷脂酶 C（PLC）在细胞信号传导中起重要作用，PLCβ 是研究较多的家族之一。本研究揭示了 PLCβ 通过诱导CSL表达抑制抗病毒细胞凋亡，进而促进病毒复制，但其诱导CSL表达的机制仍需进一步研究。
研究局限性
本研究虽揭示了两种水稻 miRNA 对 RSV 复制的调控作用，但缺乏对其在植物来源的 EV 和灰飞虱群体中内源性浓度的充分量化，实验中使用的 miRNA 激动剂和拮抗剂的剂量可能无法准确反映灰飞虱从 EV 中自然获取的 miRNA 的生理水平。
