探秘秋葵籽肽：抗氧化与抗细胞氧化应激的天然宝藏

为探究秋葵籽蛋白水解物的抗氧化活性及对氧化应激的抑制作用，研究人员对其进行生物测定引导的分级分离。结果发现，部分肽段具有良好的 DPPH 自由基清除能力，能抑制 LPS 刺激的 RAW 264.7 细胞内 ROS 和 NO 产生，有望开发为天然抗氧化产品。

　　在健康养生理念日益盛行的当下，人们对天然抗氧化剂的需求愈发迫切。氧化应激与多种疾病，如炎症、衰老、癌症以及心血管疾病等紧密相连。过多的活性氧（ROS）和一氧化氮（NO）会打破体内的氧化平衡，引发细胞损伤和组织病变。虽然许多食物被认为具有抗氧化潜力，但秋葵籽作为一种营养丰富却未被充分开发的资源，其在抗氧化领域的价值尚待挖掘。在此背景下，为了寻找新的天然抗氧化来源，国外研究人员开展了关于秋葵籽肽抗氧化活性及对氧化应激抑制作用的研究，相关成果发表在《Applied Food Research》上，这一研究为开发天然抗氧化产品提供了新方向，具有重要的理论和实践意义 。

研究人员运用了多种关键技术方法。首先，通过酶解法（使用胰蛋白酶、糜蛋白酶和胃蛋白酶）对秋葵籽蛋白进行水解，获得水解产物。接着，采用固相萃取（SPE）技术对水解产物进行脱盐处理，去除杂质。然后，利用亲水相互作用液相色谱（HILIC）和反相高效液相色谱（RP - HPLC）对肽段进行分级分离。最后，运用 DPPH 自由基清除活性测定、MTT 法、DCFH - DA 荧光检测以及一氧化氮检测等方法，对肽段的抗氧化活性和对细胞氧化应激的影响进行评估。

研究结果

1. 秋葵籽蛋白提取：采用超声辅助十二烷基硫酸钠（SDS）提取法和三氯乙酸（TCA）沉淀法从秋葵籽中提取蛋白，其蛋白得率为 24.25 ± 0.25%，这一结果与其他相关研究相近，表明秋葵籽作为蛋白质来源具有可行性，为后续研究提供了物质基础。
2. 蛋白水解物：经三种酶水解后，秋葵籽蛋白水解物的得率为 14.39 ± 0.85% 。较低的得率可能是由于水解后小肽（≤3kDa）比例较低，这也促使研究人员进一步对水解物进行处理，以提高目标肽段的纯度和含量。
3. SPE 脱盐后的抗氧化活性：经 SPE 脱盐后的秋葵籽蛋白水解物（MW ≤ 3kDa）表现出良好的 DPPH 自由基清除能力，抗氧化活性达 62.55 ± 1.84%，IC₅₀值为 0.37 ± 0.79mg/mL。与其他种子蛋白水解物相比，其抗氧化活性具有一定优势，这说明 SPE 处理有助于提高肽段的抗氧化活性，可能是因为去除了一些干扰成分。
4. HILIC 纯化结果：利用 HILIC 对小肽进行分级分离，得到八个不同组分。其中，HILIC_70% ACN + 0.1% FA 组分的 DPPH 自由基清除活性最高，达 70.71 ± 0.82%，IC₅₀值为 0.56mg/mL。这可能是由于该组分中同时存在疏水和亲水肽段，且疏水氨基酸在抗氧化过程中发挥了重要作用。
5. RP - HPLC 分离及活性测定：对 HILIC 70% ACN + 0.1% FA 组分进一步用 RP - HPLC 分离，得到五个组分。其中，RP - HPLC_3 组分的抗氧化活性最高，这使得该组分被选用于后续更深入的研究，以明确其具体的抗氧化成分和作用机制。
6. 棉酚含量测定：通过 HPLC 分析发现，经 SPE 纯化后的秋葵籽蛋白水解物中不含棉酚。棉酚是一种有毒的多酚化合物，存在于秋葵籽中，可能对人体健康造成危害。这一结果表明，该水解物在后续实验和应用中不存在棉酚毒性风险，为其安全性提供了保障。
7. 肽段序列鉴定：运用 LC - MS/MS 分析，在 RP_HPLC HILIC 70%_3 组分中鉴定出 11 种肽段。这些肽段的氨基酸组成中含有较多疏水氨基酸，部分还含有亲水、碱性和芳香族氨基酸。氨基酸的组成和相互作用对肽段的抗氧化活性起着关键作用，疏水氨基酸比例较高的肽段往往具有更强的抗氧化能力。
8. 细胞毒性评估：MTT 法检测结果显示，浓度低于 1mg/mL 的肽段对 RAW 264.7 细胞无细胞毒性，细胞存活率在 0.0001 - 1mg/mL 浓度范围内均高于 100%。这表明在该浓度范围内，肽段不仅不会对细胞产生毒性，甚至可能对细胞生长有一定的促进作用，为其在生物体内的应用提供了安全性依据。
9. 对 ROS 形成的影响：在 LPS 诱导的 RAW 264.7 细胞中，肽段预处理能显著抑制 ROS 的形成。与 LPS 处理组相比，不同浓度肽段处理后 ROS 形成倍数降低，抑制率超过 36%。这表明秋葵籽肽具有潜在的抑制细胞氧化损伤的能力，可能通过清除自由基等机制发挥作用。
10. 对 NO 产生的抑制作用：研究发现，肽段能显著抑制 LPS 刺激的 RAW 264.7 细胞中 NO 的产生。随着肽段浓度的变化，NO 产生量呈现不同程度的降低，这说明秋葵籽肽在调节细胞炎症反应方面具有一定的作用，有望成为控制炎症相关疾病的潜在生物分子。

研究结论与讨论

本研究成功从秋葵籽中分离出具有显著抗氧化活性的肽段。这些肽段不仅能够有效清除 DPPH 自由基，还能抑制 LPS 刺激的 RAW 264.7 细胞内 ROS 和 NO 的产生，展现出良好的抗氧化和抗细胞氧化应激能力。研究中还明确了肽段的氨基酸组成与抗氧化活性之间的关系，发现疏水氨基酸在其中起着重要作用。同时，去除棉酚保证了肽段的安全性，为后续开发利用奠定了基础。

该研究成果在生命科学和健康医学领域具有重要意义。在食品领域，这些抗氧化肽可作为天然抗氧化剂应用于功能性食品和营养补充剂的开发，满足人们对健康食品的需求。在医学领域，其有望为预防和治疗氧化应激相关疾病提供新的策略和天然药物来源。此外，该研究还为合理利用果蔬废弃物，从其中提取生物活性化合物提供了范例，促进了资源的高效利用和可持续发展。未来研究可以进一步深入探讨这些肽段在体内的作用机制和代谢途径，以及如何优化提取和制备工艺，提高其产量和活性，为其实际应用提供更坚实的理论和技术支持。