肌肉 mTOR：调控铁稳态与自噬性铁蛋白降解的关键枢纽及潜在治疗靶点

在肌肉疾病研究中，mTOR 与铁稳态的关系尚不明确。研究人员针对肌肉特异性 mTOR 基因敲除小鼠开展研究，发现 mTOR 缺失影响肌肉铁代谢，且亚精胺可改善相关缺陷。该研究为肌肉疾病治疗提供新思路。

　　在人体中，约 10 - 15% 的全身铁存在于骨骼肌。铁在肌肉中参与多种重要生理过程，如氧气运输、维持线粒体功能等。然而，铁过量或缺乏都会对肌肉功能产生不良影响，像铁过量会引发氧化应激、线粒体功能障碍等，铁缺乏则会损害肌肉完整性。此前研究发现，细胞内铁稳态受转录和转录后水平的调控，涉及多种蛋白，如负责铁摄取的转铁蛋白受体 1（TFR1）、储存的铁蛋白（FTL 和 FTH）以及输出的铁转运蛋白（FPN） 。同时，机制性雷帕霉素靶蛋白（mTOR）在细胞铁稳态中也起着重要作用，但在骨骼肌中，mTOR 信号与铁稳态之间的复杂相互作用仍不清楚。此外，之前研究表明，小鼠骨骼肌中 mTOR 的靶向缺失会导致进行性肌病。因此，为了探究 mTOR 缺乏对小鼠骨骼肌铁稳态的影响以及其在 mTOR 相关肌病进展中的潜在作用，法国 Université Claude Bernard Lyon 1 等机构的研究人员展开了此项研究。该研究成果发表在《Cellular and Molecular Life Sciences》上，对深入理解肌肉疾病的发病机制和寻找潜在治疗策略具有重要意义。

研究人员采用了多种关键技术方法。在动物实验方面，使用肌肉特异性 mTOR 基因敲除小鼠（mTOR^mKO）和对照小鼠，对不同年龄、性别的小鼠进行研究。通过免疫印迹法检测蛋白质表达水平；利用转录表达分析技术，包括 RNA 提取、逆转录和定量 PCR，来研究基因表达情况；采用铁测定试剂盒测量肌肉中的铁含量；运用 RNA 电泳迁移率变动分析（REMSA）评估 IRP 与铁反应元件（IRE）的结合活性；借助肌肉组织学、免疫组织化学和成像技术观察肌肉结构和铁沉积等情况。

研究结果：

• 肌肉 mTOR 缺失改变慢氧化肌铁水平：研究发现，7 周龄雄性 mTOR^mKO小鼠的比目鱼肌（富含慢氧化纤维）铁含量显著降低，而趾长伸肌（PLA，富含快糖酵解纤维）与对照组无显著差异。到 25 周龄时，比目鱼肌和趾长伸肌的铁含量与对照组均无显著差异。此外，分析其他生物金属发现，两种肌肉类型在不同年龄都存在锌（Zn）含量增加、铜（Cu）和锰（Mn）含量降低的情况。进一步研究发现，25 周龄 mTOR^mKO小鼠比目鱼肌中 Fe (III) 含量增加，Fe (II) 含量减少，但未出现铁过载的迹象，且氧化损伤指标未增加。这表明 mTOR 对维持慢氧化肌铁平衡至关重要，其缺失不会诱导氧化损伤。
• mTOR^mKO小鼠未发生类似 ISCU 的肌病：mTOR^mKO小鼠比目鱼肌中 Fe (II) 水平降低，可能影响铁硫簇（ISC）蛋白合成。研究发现，20 - 23 周龄 mTOR^mKO雄性小鼠比目鱼肌中 ISC 组装蛋白 ISCU 和 frataxin（FXN）的表达在 mRNA 和蛋白水平均降低，部分 ISC 含线粒体蛋白也下调，但 mRNA 水平也下降，难以确定 mTOR 缺乏对这些蛋白稳定性的影响。同时，mTOR^mKO小鼠比目鱼肌中丙酮酸脱氢酶（PDH）的脂酰化水平在归一化后与对照组无差异，且趾长伸肌未出现相关蛋白的下调。这些数据强烈表明，肌肉 mTOR 并非直接参与 ISC 生物合成或维持其完整性，突变比目鱼肌中的线粒体变化可能是肌病进展过程中线粒体重塑的结果。
• mTOR 缺失改变骨骼肌铁相关基因表达谱：在 20 - 23 周龄雄性 mTOR^mKO小鼠的比目鱼肌和趾长伸肌中，研究人员发现 TFR1 蛋白和 mRNA 表达下降，而 FTL、FTH 和 FPN 蛋白表达增加，但其 mRNA 水平降低，这反映了一种转录后调节机制。7 周龄 mTOR^mKO小鼠的比目鱼肌已出现类似变化，且轻度受影响的趾长伸肌也有类似趋势。这表明 mTOR 缺失会破坏骨骼肌铁相关基因的表达谱，且这种影响与整体铁含量和肌肉病理无关，说明 mTOR 在维持骨骼肌铁相关基因的正常表达中起直接作用。
• 肌肉 mTOR 缺失损害 HIFs 和 NRF2 铁调节通路：mTOR 通路可增强缺氧诱导因子（HIFs）和核因子 E2 相关因子 2（NRF2）的活性，这两个转录因子直接控制铁代谢基因的表达。研究发现，20 - 23 周龄雄性 mTOR^mKO小鼠比目鱼肌中 HIF2α 和 NRF2 的蛋白和 mRNA 表达均显著降低，多个 HIF 和 NRF2 靶基因也下调。7 周龄 mTOR^mKO小鼠的比目鱼肌已出现 NRF2 及其靶基因 NQO1 的强烈下调。这些结果表明，肌肉 mTOR 的缺失减弱了 HIFs 和 NRF2 的活性，这可能是关键铁相关基因 mRNA 水平下降的原因。
• 肌肉 mTOR 缺乏减轻 IRPs 对铁蛋白合成的抑制并促进 NCOA4 介导的铁蛋白自噬：mTOR 缺乏与骨骼肌中铁蛋白含量增加和 NRF2 下调有关。NRF2 通过调节 E3 泛素连接酶 HERC2 控制铁蛋白的合成和降解。研究发现，20 - 23 周龄雄性 mTOR^mKO小鼠比目鱼肌中 FBXL5 蛋白表达增加，IRP1 和 IRP2 蛋白水平降低，REMSA 结果显示 IRP 功能受到抑制。同时，NCOA4 蛋白水平升高，这可能促进铁蛋白自噬。7 周龄 mTOR^mKO小鼠的比目鱼肌也出现类似变化。这表明 mTOR 缺乏和 NRF2 活性下降可能通过 FBXL5 - IRP 轴和 NCOA4 影响骨骼肌铁蛋白含量。
• 比目鱼肌铁蛋白自噬受持续 mTOR 缺乏阻碍：mTOR 缺乏会使肌肉中 NCOA4 蛋白上调，但慢性 AKT/PKB 激活导致自噬通量随年龄下降，可能限制铁蛋白自噬。研究发现，25 周龄雌性 mTOR^mKO小鼠比目鱼肌出现自噬诱导和阻断的分子标记，铁蛋白（FTL）与 p62 共定位增加，但与 LAMP1 阳性的内溶酶体区室结合较少，表明铁蛋白处理受损。7 周龄 mTOR^mKO小鼠的比目鱼肌中，FTL/p62 和 FTL/LAMP1 共定位与对照组相似。给予 22 周龄雌性 mTOR^mKO小鼠亚精胺（spermidine）处理 3 周后，FTL 水平显著降低，自噬通量改善，FTL 与 LAMP1 的结合增加。这表明亚精胺可改善 mTOR^mKO小鼠比目鱼肌中的铁蛋白自噬。
• 亚精胺治疗使 AKT/FOXO 信号正常化，但未能诱导 mTOR^mKO比目鱼肌中的自噬相关基因表达：亚精胺可通过调节 AKT/PKB - FOXO 信号诱导自噬。研究发现，25 周龄雌性 mTOR^mKO小鼠比目鱼肌中 AKT/PKB 激活，亚精胺处理后，AKT^S473磷酸化和 pFOXO1^S256/FOXO1 比值降低，FOXO3 核定位增加，但自噬相关基因的表达水平仍较低。此外，3 周的亚精胺治疗对 mTOR^mKO小鼠的整体肌病表型改善有限。

研究结论与讨论：
该研究揭示了 mTOR 信号与铁代谢之间的复杂相互作用。在不同类型的肌肉中，mTOR 缺失导致了不同的铁调节模式。慢氧化型的比目鱼肌铁含量先降低后恢复正常，而快糖酵解型肌肉铁含量基本正常。mTOR 缺失还破坏了关键的细胞内铁调节机制，包括 NRF2、HIFs 和 AKT/PKB 介导的自噬信号通路。亚精胺治疗可改善 mTOR^mKO小鼠比目鱼肌中的铁蛋白自噬，使 AKT/FOXO 信号正常化，但对整体肌病表型的改善效果有限。这可能是由于 mTOR 缺失影响了蛋白质合成和铁稳态，阻碍了肌肉的修复和再生。该研究为理解肌肉疾病中铁代谢的异常提供了重要依据，表明调节 mTOR 活性可能是改善肌肉铁过载的潜在策略，同时亚精胺可能是治疗因自噬阻断导致铁蛋白自噬受损的有效药物，但还需要进一步研究确定最佳治疗时机和疗程。