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口腔黏膜伤口愈合迅速原因不明，研究人员探究变形链球菌衍生的细胞外囊泡（Sm EVs）对伤口愈合影响。发现 Sm EVs 可促进皮肤伤口愈合，其 tRNA 变体起关键作用且依赖 TLR3 通路，为慢性伤口治疗提供新思路。
在人体的口腔中，隐藏着一个庞大而神秘的微生物世界，数十亿的细菌在这里 “安营扎寨”，与人体和谐共处。其中，变形链球菌（Streptococcus mutans）是口腔中的 “常住居民” 之一，虽然它常被认为与龋齿的发生有关，但近年来，科学家们发现这些小小的细菌似乎还藏着一些不为人知的 “秘密技能”。与此同时，皮肤和口腔黏膜作为人体抵御外界侵害的第一道防线，它们的伤口愈合过程一直是医学研究的重点领域。令人疑惑的是，口腔黏膜伤口往往能快速愈合，且几乎不留疤痕，可背后的机制却如同蒙上了一层神秘的面纱，一直没有被完全揭开。这不仅让科学家们对口腔黏膜伤口愈合的奥秘充满好奇，也引发了他们的思考：能否从口腔微生物中找到加速皮肤伤口愈合的 “钥匙” 呢？基于这些疑问，来自韩国庆北国立大学（Kyungpook National University）的研究人员开展了一项意义重大的研究。
研究人员将目光聚焦在变形链球菌衍生的细胞外囊泡（Sm EVs）上，他们想弄清楚这些纳米级的小囊泡是否对皮肤伤口愈合有影响，以及其中的 RNA 货物在这一过程中扮演着怎样的角色。经过一系列深入的研究，他们发现 Sm EVs 就像是皮肤伤口愈合的 “加速引擎”，能够显著促进上皮细胞的增殖和迁移，进而加速伤口的愈合进程。而且，他们还找到了其中的关键 “信使”——tRNA 变体，尤其是 tRNA-Met 变体（Oligo 1），它就像一把 “神奇的钥匙”，通过激活 Toll 样受体 3（TLR3）通路，开启了伤口愈合的大门。这一发现意义非凡，为慢性、难愈合的皮肤伤口治疗带来了全新的希望，有望开发出更有效的治疗策略。该研究成果发表在《Journal of Nanobiotechnology》杂志上。
在研究过程中，研究人员运用了多种关键技术方法。他们从韩国典型培养物保藏中心（KCTC）获取变形链球菌和大肠杆菌，通过特定的培养条件和方法分离得到细胞外囊泡（EVs） 。利用 RNA 测序技术分析 Sm EVs 中的 RNA 成分，合成相应的 tRNA 寡聚体并导入大肠杆菌来源的 EVs（Ec EVs） 。借助免疫荧光（IF）染色和免疫组化（IHC）染色技术，观察细胞和组织的变化。还通过体内小鼠实验，对比不同处理组的伤口愈合情况。
研究结果如下：
- Sm EVs 的分离与特性：通过透射电子显微镜（TEM）和纳米颗粒跟踪分析（NTA），研究人员发现分离得到的 Sm EVs 呈现球形，大小在 50 - 400nm 之间，且含有独特的蛋白质，这些蛋白质与变形链球菌细胞内的蛋白质有所不同。
- Sm EVs 促进黏膜类器官上皮细胞增殖和迁移：研究人员培养了来自人类口腔黏膜组织的类器官，用荧光标记的 Sm EVs 处理后发现，这些囊泡能够被类器官摄取。在不同浓度 Sm EVs 处理实验中，发现较高浓度（10? - 10?颗粒 /mL）的 Sm EVs 可使类器官细胞更分散、有明显的扩散现象，表明其促进了细胞迁移。进一步用抗 Ki67 抗体进行 IF 染色证实，Sm EVs 处理 24h 的类器官中，Ki67 表达显著升高，意味着细胞增殖增加。
- Sm EVs 促进小鼠背部皮肤伤口愈合：在小鼠体内实验中，用 4mm 打孔器在小鼠背部皮肤上制造伤口，实验组每天用含有 10?颗粒 /mL Sm EVs 的溶液处理伤口，对照组用 PBS 处理。结果显示，从第 1 天开始，Sm EVs 处理组的伤口面积就明显小于 PBS 对照组，且这种趋势一直持续到第 6 天。组织学分析发现，PBS 组伤口愈合不完全，表皮较薄且不规则，真皮层有分离和肉芽组织；而 Sm EVs 处理组伤口愈合明显改善，表皮相对均匀，真皮层致密。
- TLR3 参与 Sm EVs 依赖的细胞增殖加速过程：为确定参与 Sm EVs 介导细胞增殖和迁移的 TLR，研究人员使用了 TLR2、TLR3 和 TLR7/8 的特异性激动剂。结果发现，TLR3 激动剂聚肌胞苷酸（poly I:C）能显著增强细胞增殖和迁移，效果与 Sm EVs 相似，而 TLR2 和 TLR7/8 激动剂则无明显作用。用 TLR3 拮抗剂 CU - CPT - 4a 预处理细胞，可抑制 Sm EVs 和 poly I:C 介导的细胞增殖和迁移。此外，IF 染色证实 Sm EV RNA 货物能被递送到细胞内的内体中，而 TLR3 主要就分布在内体中。
- EGFR 参与 Sm EVs 介导的细胞增殖加速过程：表皮生长因子（EGF）信号通路对上皮细胞增殖至关重要，且 TLR3 信号与 EGFR 密切相关。研究发现，Sm EVs 可增强 EGFR 的磷酸化，用 EGFR 抑制剂如吉非替尼（gefitinib）和阿法替尼（afatinib）预处理，可显著降低 Sm EVs 介导的 EGFR 磷酸化和细胞增殖 / 迁移。用 siTLR3 预处理也会减弱 Sm EV 诱导的 EGFR 磷酸化，表明 TLR3 在 Sm EV 介导的 EGFR 激活中起关键作用。值得注意的是，Sm EVs 对口腔鳞状细胞癌（OSCC）类器官的增殖和迁移没有显著影响，说明其促增殖和迁移作用仅限于正常黏膜细胞。
- Sm EVs 通过 TLR3 增强黏着斑和伤口愈合：黏着斑复合物的形成是细胞迁移的关键步骤。研究人员分析发现，Sm EVs 处理 24h 可导致类器官中黏着斑激酶（FAK）激活，进而促进黏着斑复合物的形成，表现为 paxillin 和肌动蛋白（actin）的共定位增加。敲低 TLR3 则会减少 Sm EV 诱导的 FAK 磷酸化，表明 TLR3 在这一过程中起关键作用。在人类舌癌组织中，Sm EVs 处理后 FAK 没有明显的磷酸化。
- Sm EV 衍生的 tRNA 变体对细胞增殖和迁移的作用：RNA 测序显示，Sm EVs 中最丰富的 RNA 是 tRNA。研究人员合成了源自 Sm EVs 的 tRNA 寡聚体（Oligos） ，并用电穿孔法将其导入 Ec EVs。实验发现，当以 1012 拷贝 /mL 的浓度将 Oligo 1 和 Oligo 3 导入 Ec EVs 后，能显著促进原代口腔上皮细胞的迁移，效果与 Sm EVs 相似，而 Oligo 2、Oligo 4 和 Oligo 5 则无明显作用。在人类原代口腔黏膜类器官实验中，携带 Oligo 1 或 Oligo 3 的 Ec EVs 可促进细胞增殖和迁移，而 Ec EVs 单独处理则无此效果。此外，用脂质体（Lipofectamine）递送合成的 Oligo 1 也能促进上皮细胞增殖和迁移，而热灭活的 Sm EVs 则失去了这种能力，表明完整的 RNA 货物对 Sm EVs 的生物活性至关重要。
- Sm EV 衍生的 tRNA 变体促进黏着斑复合物形成：研究人员用 Ec EVs 或携带 Oligo 1 的 Ec EVs 处理类器官 24h 后发现，携带 Oligo 1 的 Ec EVs 可导致黏着斑复合物形成，表现为 paxillin 和 actin 的共定位增加。同时，用 Sm EVs 和携带 Oligo 1 的 Ec EVs 处理后，Src 激酶和 FAK 的磷酸化显著增加，表明 Src 激活参与了 FAK 激活的信号级联反应。
- Sm EV 衍生的 tRNA 变体增强小鼠皮肤伤口愈合：将合成的 Oligo 1 电穿孔导入 Ec EVs 后，应用于小鼠背部皮肤伤口。结果显示，处理 4 天后，携带 Oligo 1 的 Ec EVs 处理组的伤口面积明显小于 PBS 和 Ec EVs 对照组。组织学分析表明，该处理组的表皮相对均匀，真皮层致密，伤口愈合情况优于对照组。
- Sm EV 衍生的 tRNA 变体在 TLR3 敲除小鼠中的作用：在 TLR3 敲除（KO）小鼠模型中，应用携带 Oligo 1 的 Ec EVs 处理伤口，与 PBS 或 Ec EVs 对照组相比，伤口愈合率没有显著差异。组织学分析也显示，三组之间的伤口愈合进展没有明显差异，这表明 TLR3 在 Sm EV 衍生的 Oligo 1 促进伤口愈合的机制中起着至关重要的作用。
在结论和讨论部分，该研究首次证实了 Sm EVs 通过 tRNA 货物，尤其是 tRNA - Met 变体，以 TLR3 依赖的机制促进上皮细胞增殖和伤口愈合。这一发现揭示了口腔共生细菌来源的 EVs 在皮肤伤口愈合中的潜在治疗价值，为开发新型治疗策略提供了理论依据。然而，目前的研究也存在一些局限性，如啮齿动物伤口愈合主要依赖伤口收缩，与人类的再上皮化过程有所不同。未来的研究需要进一步探索其他 EV 成分的作用，优化 RNA 递送机制，评估 Sm EVs 在体内的代谢和清除途径，以及解决大规模生产和临床应用中的相关问题。尽管面临挑战，但这项研究无疑为皮肤伤口愈合领域开辟了新的研究方向，有望为慢性伤口患者带来新的希望。
