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L - 半胱氨酸（l-cysteine）生产面临细胞毒性、碳产率低、出口蛋白选择性低等问题。研究人员通过体内代谢控制分析（MCA），交换 L - 半胱氨酸出口蛋白，提高了其产量。该研究为优化生产工艺提供了新策略，推动了生物技术发展。
在生命科学的微观世界里，微生物宛如神奇的 “小工匠”，为人类制造出各种重要的物质。L - 半胱氨酸（l-cysteine）就是其中一种具有极高价值的非必需蛋白质氨基酸，它在制药、食品、化妆品和动物饲料等多个行业都有着广泛应用。在制药领域，它是 N - 乙酰 - L - 半胱氨酸的前体，可用于减轻人体氧化应激、增强谷胱甘肽生成以及降低对麻醉剂的依赖；在食品行业，它能改善烘焙食品的面团质量；在化妆品行业，它是永久烫发制剂的成分；在动物饲料中，它可满足牛的硫需求并提升羊毛生产的美观度。
然而，目前微生物发酵生产 L - 半胱氨酸的过程却面临诸多挑战。一方面，L - 半胱氨酸及其前体 O - 乙酰丝氨酸（OAS）对细胞具有较高的细胞毒性；另一方面，整个细胞生产过程中碳产率较低，而且在生产过程中，OAS 会与 L - 半胱氨酸一起被出口蛋白运出细胞，导致前体损失，其在发酵培养基中会自发转化为 N - 乙酰丝氨酸（NAS）并积累，影响生产效率和产品质量。
为了解决这些问题，来自德国慕尼黑工业大学（Technical University of Munich）的研究人员 Daniel Alejandro Caballero Cerbon 和 Dirk Weuster-Botz 开展了深入研究。他们运用体内代谢控制分析（MCA）技术，对大肠杆菌生产 L - 半胱氨酸的工艺进行优化。研究发现，通过交换 L - 半胱氨酸出口蛋白 YdeD 为 YfiK，可使发酵过程结束时 L - 半胱氨酸的最大浓度提高 37%，达到 33.8 g/L-1 ，并且由于减少了 OAS 形式的碳损失，细胞活性得以保持，L - 半胱氨酸的生产时间至少可延长 20 小时。这一研究成果发表在《Microbial Cell Factories》上，为 L - 半胱氨酸的生产工艺优化提供了新的方向和策略，有助于提高生产效率，降低生产成本，推动相关产业的发展。
研究人员在这项研究中运用了多种关键技术方法。首先是代谢分析技术，利用通量平衡分析（FBA）和通量方差分析（FVA），结合大肠杆菌基因组规模代谢模型 iJO1366，对代谢流分布进行定量预测；通过热力学通量平衡分析（TFA），添加热力学约束，确定反应的最可行方向。其次是分析检测技术，采用高效液相色谱（HPLC）对葡萄糖、磷酸盐、L - 半胱氨酸等多种物质进行定量测定；运用液相色谱 - 质谱联用（LC-MS）技术对细胞内代谢物进行定量分析。
下面来看具体的研究结果：
- 体内代谢控制分析结果：对从分批补料生产过程中取出的大肠杆菌 W3110 pCysK 进行体内 MCA 分析。通过短期扰动实验，研究人员获得了 12 种不同的代谢平衡状态，并以此计算出 13 种不同的细胞内碳通量分布。结果发现，乙酰辅酶 A 合酶（ACS）和琥珀酰辅酶 A 合酶（SUCOAS）对中心碳代谢有高度控制作用；在 L - 半胱氨酸生物合成途径中，L - 半胱氨酸合酶（CYSS）、磺基 - L - 半胱氨酸合酶（SLCYSS）和出口蛋白 YdeD 对代谢通量的控制程度较高，且 CYSS 和 SLCYSS 之间存在竞争关系。此外，虽然 YdeD 导致细胞内 OAS 缺乏，但它对 L - 半胱氨酸生物合成途径的大多数通量具有正的通量控制系数。
- L - 半胱氨酸生产实验结果：研究人员构建了携带替代出口蛋白 YfiK 的菌株大肠杆菌 W3110 pCysK_yfiK_nRBS，并进行分批补料 L - 半胱氨酸生产实验。结果显示，与携带 YdeD 的菌株相比，该菌株减少了 OAS 的出口，增加了生物量，最终生物量浓度达到 85 g/L-1 ，同时 L - 半胱氨酸的最大浓度提高到 33.8 g/L-1 ，选择性从 0.81 提升至 1.76。不过，由于碳在细胞生长和产物形成之间的分配问题，该菌株在 20 - 30 小时的 L - 半胱氨酸体积生产力略低于携带 YdeD 的菌株，但因其细胞活性延长，最大体积生产力可维持的时间比携带 YdeD 的菌株长 20 小时。
研究结论和讨论部分指出，体内 MCA 分析表明，提高出口蛋白活性并减少 OAS 出口可提高 L - 半胱氨酸的生产力。交换出口蛋白 YdeD 为 YfiK 后，细胞活性增加，L - 半胱氨酸产量显著提高，生产时间得以延长。这证明了体内 MCA 方法在确定合理菌株优化靶点方面的有效性，并且通过两轮菌株优化解决细胞内 OAS 缺乏问题后，L - 半胱氨酸途径内的通量控制动态可能发生了变化。此外，研究还强调了菌株工程必须与工艺工程相结合，以适应改良菌株的新需求，例如在使用大肠杆菌 W3110 pCysK_yfiK_nRBS 进行生产时，需要调整底物进料速率以防止底物限制。同时，对于未来的工业规模化生产，还需要考虑高氧气需求可能导致的问题。这项研究为 L - 半胱氨酸的生产工艺优化提供了重要的理论依据和实践指导，为相关领域的进一步研究和产业发展奠定了坚实基础。
