优化 dsRNA 序列用于害虫防治与研究：dsRIP 网络平台的创新应用

在害虫防治与基因功能研究中，RNA 干扰（RNAi）极具潜力，但优化 dsRNA 序列的知识和工具多基于人类数据，不适用于害虫防治。研究人员开展了优化 dsRNA 序列的研究，确定了相关序列特征并开发 dsRIP 平台，提升了 RNAi 效果，意义重大。

　　在全球人口持续增长的当下，粮食需求与日俱增。然而，农作物却深受病虫害的威胁，害虫不仅造成大量农作物减产，还可能传播严重的人类疾病。当前，化学农药是防治害虫的主要手段，但长期大量使用化学农药带来了诸多问题。一方面，害虫对化学农药产生了抗药性，使得农药的防治效果大打折扣；另一方面，化学农药对非靶标生物，如蜜蜂和害虫的天敌等，造成了严重的伤害，破坏了生态平衡。因此，寻找一种更加环保、高效的害虫防治方法迫在眉睫。

RNA 干扰（RNAi）技术的出现，为害虫防治带来了新的希望。RNAi 是一种能够特异性沉默基因表达的机制，通过向细胞内导入双链 RNA（dsRNA），dsRNA 会被加工成小干扰 RNA（siRNA），进而识别并切割与之互补的 mRNA，实现基因沉默。在害虫防治领域，利用 RNAi 技术靶向害虫的关键基因，有望达到控制害虫种群数量的目的。同时，RNAi 在基因功能研究中也发挥着重要作用，有助于深入了解生物的遗传信息传递和调控机制。但目前，优化 dsRNA 序列以提高 RNAi 效果的知识和工具大多基于人类数据，这些知识和工具在昆虫害虫防治中可能并非最优。因此，明确昆虫中有效 dsRNA 序列的特征，并开发相应的优化工具，对于提升 RNAi 在害虫防治和研究中的应用效果至关重要。

德国哥廷根大学的研究人员 Doga Cedden、G?zde Güney、Michael Rostás 和 Gregor Bucher 针对上述问题展开了深入研究 。他们的研究成果发表在《BMC Biology》上，为 RNAi 技术在害虫防治和基因功能研究中的应用提供了重要的理论支持和实用工具。

研究人员采用了多种关键技术方法。在昆虫饲养方面，分别在特定条件下饲养赤拟谷盗（Tribolium castaneum）、甘蓝茎跳甲（Psylliodes chrysocephala）和科罗拉多马铃薯甲虫（Leptinotarsa decemlineata）。通过构建 siRNA 插入的 dsRNA 和完全互补的 dsRNA，利用生物测定实验来评估不同 dsRNA 的杀虫效果。运用 RISC 结合的小 RNA 测序技术，分析 dsRNA 处理后昆虫体内 RISC 结合的 siRNA 情况。此外，还进行了叶片消耗实验，并运用多种统计分析方法对实验数据进行处理和分析。

研究结果如下：

1. 鉴定与杀虫效果相关的 siRNA 特征：研究人员测试了 31 种针对赤拟谷盗同一关键基因不同区域的 siRNA 的杀虫效果。通过 Cox 回归分析发现，热力学不对称性、反义链自我折叠能量得分、反义链第 9 - 14 位核苷酸的 GC 含量以及反义链第 10 位核苷酸处的腺嘌呤，这四个特征与杀虫效果显著相关。而一些在人类细胞研究中被认为重要的特征，如 mRNA 可及性等，在昆虫实验中并非重要的预测指标。
2. 测试基于 siRNA 特征的 dsRNA 设计：研究人员选取了 8 个在赤拟谷盗全基因组 RNAi 筛选中确定的有效靶基因，设计了具有高或低平均 siRNA 功效得分的 dsRNA。实验结果表明，在大多数测试的靶基因中，针对开放阅读框（ORF）且具有高平均 siRNA 功效得分的 dsRNA 片段，其杀虫效果优于低平均 siRNA 功效得分的片段。此外，统计分析证实，dsRNA 的 siRNA 得分是杀虫效果最重要的正向预测指标，且靶向 ORF 比靶向非翻译区（UTR）具有更高的杀虫效果。
3. 高得分 dsRNA 具有更高的 RISC 结合反义 siRNA 链比例：对 dsRNA 处理后的赤拟谷盗幼虫进行 RISC 结合的 sRNA 测序，发现高 siRNA 功效得分的 dsRNA 在大多数情况下，其反义 / 正义 siRNA 链比例更高。这表明 dsRNA 功效的提高可能部分归因于更多的反义 siRNA 结合到 RISC 中。同时，研究人员还发现高丰度的 siRNA 在序列上存在一些特征，如 5′端富含尿嘧啶（U）、鸟嘌呤（G）含量较低，中间部分尤其是第 8 和 12 位富含 G。
4. 应用确定的参数增强 RNAi 介导的害虫防治效果：研究人员在甘蓝茎跳甲和科罗拉多马铃薯甲虫中测试了基于 dsRIP 设计的 dsRNA 的效果。结果显示，在甘蓝茎跳甲中，dsRIP 设计的 dsRNA 相比之前研究使用的 dsRNA，杀虫效果显著提高，且对部分靶基因的取食抑制效果也明显改善。在科罗拉多马铃薯甲虫中，dsRIP 设计的 dsRNA 在低浓度下表现出更高的杀虫效果和取食抑制效果。这表明基于 siRNA 特征的 dsRNA 优化策略在不同昆虫物种中均适用，且口服递送 dsRNA 时也能发挥作用。
5. dsRIP 网络平台：为了满足害虫防治和基因功能研究的需求，研究人员开发了 dsRIP 网络平台。该平台集成了多个工具，包括有效的 RNAi 靶基因查找器、dsRNA 功效优化器、脱靶最小化器和引物设计器。靶基因查找器可根据赤拟谷盗全基因组 RNAi 筛选结果，推断其他物种中的潜在有效靶基因；功效优化器利用研究确定的 siRNA 特征，预测靶基因中具有最高 RNAi 功效的序列；脱靶最小化器通过查找潜在脱靶位点，计算安全得分，帮助选择对非靶标生物影响最小的 dsRNA 序列；引物设计器则为体外转录合成 dsRNA 提供有效的引物。

研究结论和讨论部分指出，本研究确定的 siRNA 序列特征和开发的 dsRIP 网络平台，显著提升了 RNAi 在害虫防治和研究中的功效和安全性。在基因功能研究方面，dsRIP 平台有助于选择更有效的 dsRNA 片段，减少脱靶效应，提高研究的准确性和灵敏度。在害虫防治方面，该研究优化了 dsRNA 设计，增强了杀虫效果，且 dsRIP 平台能够帮助科研人员和相关从业者更方便地设计和筛选有效的 dsRNA，推动 RNAi 技术在害虫防治领域的广泛应用。然而，研究也存在一些局限性。例如，不同昆虫类群中 RNAi 关键酶存在差异，可能影响 dsRNA 的加工和作用机制，未来需要针对不同昆虫类群进一步验证和调整 dsRIP 平台的参数。此外，一些未被研究的因素，如靶基因的剪接变体等，也可能影响 dsRNA 的功效，需要进一步深入研究。尽管如此，本研究为 RNAi 技术在害虫防治和基因功能研究中的应用奠定了坚实的基础，具有重要的理论和实践意义。