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本文介绍了通过鲁棒矩阵分解实现散射介质中荧光显微镜成像的研究（RNP）。RNP 能有效克服散射组织环境中信号和背景干扰问题，在多方面提升成像效果，为生物医学研究提供了有力工具。
研究背景
荧光显微镜在生物医学研究中具有重要意义，它能够实现细胞结构和动态过程的高分辨率可视化，为探究细胞功能和分子相互作用提供关键信息。然而，传统荧光显微镜依赖于弹道光子成像，在面对散射介质时存在显著局限性。生物组织作为高度异质的散射介质，其内部不同的折射率会导致光子散射，使得成像的精细细节被模糊，严重限制了传统荧光显微镜在需要穿透厚层或光密度高的组织成像中的应用。
为了克服光散射带来的挑战，过去二十年里，研究人员开发了多种方法。例如，通过门控机制（如时间、相干性和偏振）分离弹道光子与散射光；利用非线性激发、更长波长和超声引导的光学成像方法，像多光子显微镜、光学相干断层扫描和声学介导断层扫描等；以及采用自适应光学方法，如基于传输矩阵表征的光学波前整形技术等。尽管这些方法取得了一定进展，但大多存在需要复杂仪器、精确校准或只能在特定条件下成像的问题，限制了其在荧光成像中的广泛应用。
此外，利用光学记忆效应和散斑相关性的方法也被提出，这些方法虽然能够在一定程度上实现散射成像，但受到光学记忆效应范围的限制，且在处理非稀疏结构或强背景信号时效果不佳。非负矩阵分解等降维技术虽有助于散射成像，但在组织成像中，面对非稀疏信号和背景干扰时，分解过程易引入伪影，影响定量精度和图像重建准确性。因此，开发一种能够准确提取被复杂组织散射环境掩盖的细胞荧光细节的稳健方法迫在眉睫。
RNP 技术介绍
在这样的背景下，研究人员提出了 RNP（robust non - negative principal matrix factorization，鲁棒非负主矩阵分解）技术。RNP 是一种能够在多种散射条件下实现荧光显微镜成像的方法，它通过将鲁棒特征提取与非负性约束相结合，有效应对了散射组织环境中由非稀疏信号和背景干扰带来的挑战。
RNP 的实验装置基于标准的直立宽场荧光显微镜构建，在照明光路中加入电动旋转扩散器产生随机散斑照明，利用 sCMOS 相机捕获样品产生的散射荧光。其算法分为三个阶段：首先，对原始散斑图像进行傅里叶域滤波，增强对比度并去除噪声；接着，通过定制的鲁棒主成分分析（RPCA）将滤波后的图像分解为稀疏特征和低秩冗余背景；最后，利用非负矩阵分解对分解后的特征进行降维，确定散斑图案特征对应的发射体，并计算相对发射体位置，从而组装得到最终的重建图像。这种算法框架增强了对强背景干扰和非稀疏信号的鲁棒性，相比传统的散斑自相关方法和现有矩阵方法，能够实现更高质量的图像重建。
RNP 的实验验证
研究人员通过一系列实验对 RNP 进行了全面的表征和验证。在对荧光假样的成像实验中，研究人员使用 RNP 对 4 - μm 荧光微球通过不同散射介质（如 3M 隐形胶带、两层 parafilm 和 800 - μm 厚的散射水凝胶膜）进行成像。结果显示，RNP 在各种散射条件下都能显著恢复信号噪声比和高结构保真度，重建的相邻微球分离峰谷距离与实际情况相符，证明了其在不同散射环境下的高分辨率成像能力。
对于 16 - μm 表面染色的微球，RNP 能够可靠地重建其结构，克服了宽场系统中使用低数值孔径（NA）物镜时常见的光学切片不足问题。在对花粉粒的成像中，RNP 成功揭示了其多样的形状和大小，而传统的非负矩阵算法因花粉粒结构密集、发射光谱宽导致散斑对比度低，无法处理大尺寸的花粉粒。
在对 16 - μm 核心染色微球通过 300 - μm 厚小鼠皮肤切片的成像实验中，RNP 能够准确区分信号与背景，实现高分辨率和清晰的重建，且对光学记忆效应范围的依赖较弱，能够处理大大超出记忆效应范围的散射区域，使视场（FOV）得到显著提升。
在细胞成像实验中，RNP 被用于对小鼠巨噬细胞样细胞（RAW 264.7）的细胞膜和细胞质以及 HeLa 细胞的成像。通过 800 - μm 厚的散射水凝胶成像时，RNP 有效地揭示了细胞膜的空心结构和细胞质的分布，并且在观察 HeLa 细胞凋亡过程中的核碎片化时，能够清晰地可视化细胞核的变化，定量分析结果也与实际情况相符，表明 RNP 能够可靠地保留定量细节。
对于散射的三维（3D）物体成像，RNP 利用散射对光空间分布的影响，有效扩展了景深（DOF）。在对 16 - μm 表面染色微球和两层不同大小微球的成像实验中，RNP 实现了超过传统显微镜数倍的 DOF，无需轴向聚焦扫描即可实现体积成像。在对水凝胶封装的人骨髓间充质干细胞（MSCs）的成像中，RNP 同样展现出增强的成像深度和扩展的 FOV，能够清晰观察到细胞在 3D 水凝胶中的分布。
在对小鼠血管和肾脏组织的成像实验中，RNP 成功重建了血管的结构细节和肾脏组织中肌动蛋白丝束的结构，即使在信号背景比低和散斑对比度差的情况下，也能保持较高的分辨率和图像质量。
RNP 的优势与局限
与先前的算法方法相比，RNP 具有诸多优势。它利用稀疏表示理论，能够在各种散射条件下有效重建物体，无需复杂的自适应光学设备，实现了超出光学记忆效应范围的 FOV 和 DOF 扩展，在低对比度散斑图像的场景中也能保持较高的空间分辨率和图像质量。
然而，RNP 也存在一定的局限性。光学记忆效应依赖于物体与散射层之间的距离，RNP 虽然能够在一定程度上超越该范围进行成像，但仍需要数百微米到毫米的距离，当物体嵌入散射介质中时，RNP 则无法有效工作。为了克服这一局限，可以探索将深度学习模型与 RNP 相结合，利用深度学习对散斑图案进行数据驱动的重建，减少对光学记忆效应的依赖。此外，将 RNP 与自适应光学结合，尽管会增加硬件复杂性，但在物体与散射层距离较小时，有望提升成像性能。
研究展望
RNP 技术为散射介质中的荧光显微镜成像带来了新的突破，为生物医学研究提供了一种强大的工具。通过将 RNP 与新兴的超分辨率成像、光场技术和深度学习框架相结合，其成像能力有望进一步扩展，为非侵入性、高分辨率成像复杂生物系统开辟新的应用前景，推动生物医学研究的发展。
