探秘 MYD88 启动子：G - 四链体和 i - 基序 DNA 结构的关键调控作用

本文聚焦于先天免疫关键衔接蛋白髓样分化初级反应蛋白 88（MYD88），发现其启动子存在可形成稳定 G - 四链体（G4）和 i - 基序（iM）的序列。这些结构能被小分子靶向，影响 MYD88 表达，为相关疾病治疗提供新方向。

　　

引言

先天免疫作为抵御感染的首道防线，当病原体相关分子与细胞表面受体结合时被触发。Toll 样受体（TLRs）在其中发挥关键作用，而髓样分化初级反应蛋白 88（MYD88）作为重要的衔接蛋白，能将细胞外刺激与内部信号转导相连接。MYD88 功能异常与免疫缺陷、自身免疫疾病及癌症密切相关，因此它成为极具潜力的治疗靶点。

DNA 是一种动态大分子，富含鸟嘌呤（G）和胞嘧啶（C）的序列可折叠成 G - 四链体（G4）和 i - 基序（iM）等二级结构。这些结构在细胞核过程中形成，且被视为表观遗传调控因子，在启动子区域能调节转录。然而，目前对 MYD88 中潜在的 DNA 二级结构研究尚少。

结果

1. GC 富集序列形成稳定结构：在 MYD88 启动子转录起始位点上游约 2kb 处，发现一段 31 个核苷酸的嘌呤（Pu）/ 嘧啶（Py）富集序列，符合典型的 G4（Pu31）或 iM（Py31）形成序列特征。通过网络算法预测及圆二色谱（CD）光谱实验证实，该序列在特定条件下可形成稳定的 G4 和 iM 结构，且其折叠依赖于 KCl 或 pH，同时该结构为分子内结构。此外，通过实验得到的 iM 转变 pH（pH_T）为 6.5，与先前报道的具有生物学相关性的启动子 iM 相符，暗示其可能在体内稳定形成并发挥生物学功能。
2. iM 独特的折叠模式：iM 结构通常具有高度动态性，为确定 MYD88 的 iM 主要折叠模式，研究人员对 Py31WT 序列中每个 C 进行单独或双位点替换，并检测其对解链温度（T_m）的影响。结果表明，特定位置的 C 对 iM 稳定性至关重要，进而提出了具有 [5:4:2] 环模式的六碱基对折叠模型。通过一维¹H NMR 和二维¹⁵N 滤波 NMR 光谱进一步验证，发现 MYD88 的 Py31 序列存在两种环异构体（5:4:2 和 5:5:2）的动态平衡。
3. 甲基化对 iM 稳定性的影响：Py31WT 序列位于 MYD88 启动子的两个 CpG 岛之一。研究发现，单个胞嘧啶的 5 - 甲基化（5mC）对 iM 稳定性影响较小，仅在部分位点引起 1°C - 3°C 的热稳定性波动。对良性和恶性 B 细胞中侧翼 CpG 岛的甲基化状态分析显示，其甲基化模式复杂且存在差异。在弥漫大 B 细胞淋巴瘤（DLBCL）细胞系中，HBL1 细胞的 MYD88 mRNA 表达最高且携带激活突变，其缺乏 CpG 5 的甲基化，这可能维持了 iM 的稳定性，从而促进了 MYD88 的表达，表明 MYD88 的 iM 可能是转录激活因子。
4. 靶向结构调节基因表达：研究人员探究了靶向启动子 iM 和 G4 结构对 MYD88 表达的调控作用。已知的 G4 配体 5,10,15,20 - 四（N - 甲基 - 4 - 吡啶基）卟啉（TMPyP4）和吡啶并嘧啶（PDS），以及小分子 33353 与 MYD88 的 iM 和 G4 存在不同的相互作用。TMPyP4 使 iM 不稳定、G4 稳定，33353 和 PDS 稳定 G4 的同时使 iM 不稳定。通过细胞荧光素酶报告基因实验和在 DLBCL 细胞系中的研究发现，TMPyP4 增加 MYD88 表达，33353 和 PDS 则降低其表达。此外，还发现染色质绝缘子和转录因子 CCCTC 结合因子（CTCF）能与 MYD88 的 iM 结合，进一步表明 G4 和 iM 结构在 MYD88 转录中发挥作用，具有作为治疗靶点的潜力。

讨论

MYD88 在先天免疫应答中至关重要，但其调控机制尚不明确。研究发现 MYD88 启动子中的 GC 富集元件可形成稳定的 DNA 二级结构，这些结构能与配体及 CTCF 相互作用，为 MYD88 的调控提供了新的视角。

MYD88 的 iM 具有独特的结构特征，如可能存在不平衡的侧翼环构象和较长的胞嘧啶序列，丰富了 iM 序列库，有助于完善相关算法。目前针对 MYD88 的治疗手段有限，而靶向其启动子结构为调节 MYD88 水平提供了新途径。虽然研究发现一些小分子可影响 G4 和 iM 稳定性及 MYD88 转录，但尚未明确 iM 稳定剂，也未完全阐明 iM 和 G4 在转录中的具体作用。此外，还需进一步研究这些转录效应是否会转化为蛋白质表达的变化，以及 G4 和 iM 在染色质中的动态平衡如何协调调控基因表达。

方法

1. 细胞培养：使用多种 DLBCL 细胞系和良性外周 B 细胞，在特定培养基中培养，并定期进行细胞活力、支原体检测及细胞系鉴定。
2. 寡核苷酸合成：由专业公司合成，进行盐或高效液相色谱（HPLC）纯化，部分进行荧光标记、甲基化修饰或¹⁵N 标记。
3. 化合物处理：购买或获取多种化合物，配制成相应浓度的储存液，再稀释至工作浓度用于实验。
4. CD 光谱分析：在特定缓冲液中制备 DNA 样品，添加化合物后在 Jasco-J1100 CD 光谱仪上检测，分析光谱并绘制熔解曲线，计算 T_m或 pH_T。
5. F?rster 共振能量转移（FRET）分析：用荧光标记的寡核苷酸在 96 孔板中进行实验，检测不同条件下的荧光发射，用于研究 KCl 依赖性、确定 pH_T及筛选化合物。
6. NMR 光谱分析：在 NMRFAM 进行 1D ¹H NMR 和 2D ¹⁵N 滤波 NMR 实验，对样品进行特殊处理和参数设置，记录并分析光谱。
7. 亚硫酸氢盐转化和焦磷酸测序：提取细胞系基因组 DNA，进行亚硫酸氢盐转化后，用特定引物扩增目标区域，通过焦磷酸测序定量分析甲基化差异。
8. 实时定量 PCR：提取细胞 RNA，反转录为 cDNA 后，用 TaqMan 探针进行实时定量 PCR，检测 MYD88 等基因的 mRNA 表达水平，并进行数据归一化处理。
9. 荧光素酶报告基因实验：构建含 MYD88 启动子序列的荧光素酶报告载体，转染细胞后进行处理，检测荧光素酶活性，评估启动子活性。
10. 细胞活力检测：采用 MTS 比色法测定细胞活力，通过非线性回归模型计算化合物的生长抑制浓度（GI₅₀）。
11. 电泳迁移率变动分析（EMSA）：用重组 GST 标记的 CTCF 蛋白与荧光标记的 DNA 寡核苷酸进行反应，在非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳，扫描凝胶并定量分析。
12. 量化和统计分析：用 ImageJ 软件对 EMSA 凝胶进行量化，用 GraphPad Prism 软件进行统计分析，根据不同实验设计选择合适的统计检验方法，以 p<0.05 为具有统计学意义。

资源可用性

1. 主要联系人：Samantha Kendrick（[e-mail]）可提供资源和试剂相关信息。
2. 材料可用性：本研究未产生新的独特材料或试剂。
3. 数据和代码可用性：生成的数据在补充信息中，部分存于 Mendeley Data 和生物磁共振数据银行（BMRB: 52998），研究未报告原始代码，其他分析数据可向主要联系人索取。

致谢

本研究得到美国国立卫生研究院（NIH）等基金支持，感谢 NMRFAM 的专业人员在 NMR 研究中的技术指导。

作者贡献

研究由 S.B. 和 S.K. 构思，S.B.、S.R.C. 和 S.K. 负责方法设计，J.D. 和 D.Y. 进行形式分析，S.B. 等多人参与调查研究，S.B. 和 S.K. 撰写初稿，多人参与审核编辑，S.B. 和 S.K. 负责可视化，S.K. 进行监督，S.K. 获取资金支持。

利益冲突声明

作者声明无利益冲突。

补充信息

补充信息包含 Figures S1 - S12、Tables S1 - S5、关键资源表等，以 PDF 和 Excel 文件形式提供。