脂质纳米颗粒包裹 siRNA：优化人源化肝脏嵌合小鼠模型，助力精准药物研发

本文通过脂质纳米颗粒（LNP）包裹针对小鼠细胞色素 P450 氧化还原酶（Por）基因的小干扰 RNA（siRNA）处理人源化肝脏嵌合小鼠（PXB - 小鼠），有效敲低 Por 基因，改善小鼠药物代谢表型，为药物研发提供更精准的动物模型，极具研究价值。

　　

引言

在药物研发过程中，从动物数据准确预测化合物在人体中的药代动力学（PK）和药效学（PD）颇具挑战，主要原因是物种差异。细胞色素 P450（CYP）介导的代谢在不同物种间存在差异，像 CYP2E1 在物种间差异较小，而 CYP1A、CYP2C 和 CYP3A 亚型的催化活性则有明显的种间差异，所以从动物模型外推代谢数据到人体时需谨慎。

肝脏是代谢化合物的关键器官，人源化肝脏动物模型因此备受关注。研究人员将人肝细胞移植到小鼠白蛋白增强子 / 启动子驱动的小鼠尿激酶型纤溶酶原激活剂转基因 / 严重联合免疫缺陷（Prkdc^scid/Prkdc^scid）（uPA/SCID）小鼠中，培育出了人源化肝脏嵌合小鼠（PXB - 小鼠）。这类小鼠肝脏中人类来源肝细胞平均占比可达 80%，其肝脏中 CYP 和非 CYP 酶的表达水平及代谢活性与人类相似，还能形成人类特异性代谢物，可作为预测人类药物代谢的良好体内模型，其分离的人肝细胞也用于体外研究。

然而，PXB - 小鼠中残留的小鼠肝细胞会干扰人类肝细胞表型的判断，影响嵌合小鼠的表型，比如药物疗效。即便在肝脏替换率高的嵌合小鼠中，某些化合物的代谢谱仍与对照小鼠相似。为解决这一问题，研究人员尝试利用脂质纳米颗粒（LNP）递送小干扰 RNA（siRNA）来调控基因表达。LNP 是经临床验证的非病毒基因递送系统，静脉注射后主要在肝脏积累，尤其是肝细胞。基于此，研究人员旨在创建一种新的人源化小鼠模型，用 LNP 包裹针对小鼠 Por 基因的 siRNA，特异性敲低残留小鼠肝细胞中的 Por 基因。

结果

1. 体外物种特异性转甲状腺素蛋白基因敲低：为验证 siRNA-LNP 方法在 PXB - 小鼠中的有效性，研究人员以转甲状腺素蛋白（Ttr/TTR）为模型基因。在体内敲低研究前，他们分别用针对小鼠 Ttr 的 siRNA（siTTR (Mm)）/LNP 和针对人类 TTR 的 siRNA（siTTR (Hs)）/LNP 处理小鼠（Hepa1-6）和人类肝癌细胞系（Huh-7）。结果显示，siTTR (Mm)/LNP 能降低 Hepa1-6 细胞中 Ttr 基因表达（IC₅₀ = 0.43 nM），但对 Huh-7 细胞中 TTR 表达无影响；siTTR (Hs)/LNP 则能抑制 Huh-7 细胞中 TTR 基因表达（IC₅₀ = 0.072 nM），对 Hepa1-6 细胞中 Ttr 表达无作用，从而证实了 siRNA 在体外的物种特异性功效。
2. LNP 递送的 siRNA 在 PXB - 小鼠中的生物分布：为探究 siRNA-LNP 系统在 PXB - 小鼠中的生物分布，研究人员给 PXB - 小鼠尾静脉注射用荧光 Cy3 标记的针对荧光素酶的 siRNA（Cy3-siLuc/LNP），4 小时后检测发现，几乎所有 siRNA 都分布在肝脏，表明该研究中使用的 LNP 制剂成功将 siRNA 靶向到肝脏。
3. siTTR (Mm)/LNP 和 siTTR (Hs)/LNP 在 SCID 小鼠中的体内敲低效果：研究人员以血浆 TTR 浓度为指标，研究 siTTR (Mm)/LNP 和 siTTR (Hs)/LNP 在 SCID 小鼠中的体内敲低效率。结果显示，所有剂量的 siTTR (Mm)/LNP（0.01、0.1 和 1.0 mg/kg）在给药第一天就显著抑制血浆 TTR 浓度，且呈剂量依赖性下降。0.1 和 1.0 mg/kg 的 siTTR (Mm)/LNP 在第 3 天几乎完全降低血浆 TTR 水平，并持续到第 7 天。而 1.0 mg/kg 的 siTTR (Hs)/LNP 对血浆 TTR 水平无影响。同时，siTTR (Mm)/LNP 能剂量依赖性降低肝脏 Ttr mRNA 水平，siTTR (Hs)/LNP 则无此作用，这表明肝脏 Ttr mRNA 水平与血浆 TTR 浓度密切相关。
4. siTTR (Mm)/LNP 和 siTTR (Hs)/LNP 在 PXB - 小鼠中的物种特异性 TTR 敲低：在 PXB - 小鼠中，siTTR (Mm)/LNP 能剂量依赖性抑制血浆小鼠 TTR 浓度，但对血浆人类 TTR 水平无影响。在肝脏中，siTTR (Mm)/LNP 也能剂量依赖性降低小鼠 Ttr mRNA 水平。相反，siTTR (Hs)/LNP 能强烈抑制血浆人类 TTR 浓度，对血浆小鼠 TTR 水平无影响，且能剂量依赖性降低人类 TTR mRNA 水平。这些结果证实了 siRNA-LNP 在 PXB - 小鼠中的物种特异性基因敲低作用。
5. 小鼠特异性 siPOR 的筛选：研究人员评估了 16 种针对 Por 基因的 siPOR (Mm) s 在 Hepa1-6 细胞中的敲低活性，筛选出 4 种 siPOR (Mm) s，在 Hep3B 细胞中进一步确认其对 POR 基因表达的影响。结果显示，siPOR (Mm) 对人类 POR mRNA 表达影响较小。在 BALB/c 小鼠中评估这 4 种 siPOR (Mm) s 的体内敲低效果，发现 SEQ03 和 SEQ10 在给药后 7 天能抑制 Por 基因表达超 80%，其中 SEQ03 敲低活性最强。
6. siPOR (Mm)/LNP 对 PXB - 小鼠残留小鼠肝细胞中 Por 基因的敲低：将筛选出的 SEQ03 封装到 LNP 中，处理 PXB - 和 SCID 小鼠。结果显示，siPOR (Mm)/LNP 处理未显著影响小鼠体重、肝脏重量、血液天冬氨酸转氨酶（AST）和丙氨酸转氨酶（ALT）水平。在基因表达方面，siPOR (Mm)/LNP 显著降低小鼠和 PXB - 小鼠肝脏中的小鼠 Por mRNA，但对 PXB - 小鼠肝脏中的人类 POR mRNA 无显著影响。由于所用抗 POR 抗体可与人类和小鼠 POR 蛋白交叉反应，通过小鼠 Por mRNA 表达结果推测，PXB - 小鼠中残留小鼠肝细胞的小鼠 POR 蛋白被有效敲低。免疫组化染色发现，siPOR (Mm)/LNP 处理的 SCID 小鼠 POR 表达明显降低，PXB - 小鼠中 ALDH1L1 阳性区域（富含小鼠肝细胞）的 POR 蛋白表达也降低，且处理后的肝细胞中出现小脂滴样空泡，与文献中肝脏特异性 Por 基因敲除（KO）小鼠的表型一致。此外，在 SCID 小鼠中，Por 敲低导致 Cyp2b10、Cyp2c29、Cyp2c38、Cyp3a11 和 Cyp3a25 显著增加，Cyp2d22 显著减少；在 PXB - 小鼠中，小鼠 Cyp2c29 显著增加，而人类 CYPs 表达无显著差异。
7. siPOR (Mm)/LNP 处理的 PXB - 和 SCID 小鼠肝脏微粒体中 S - 华法林的代谢：研究人员检测了 S - 华法林的主要代谢物 4′- 羟基华法林、6 - 羟基华法林和 7 - 羟基华法林。在 SCID 小鼠中，siPOR (Mm)/LNP 处理组所有代谢物的内在清除率（CL_int）均降低。在 PXB - 小鼠中，siPOR (Mm)/LNP 处理最显著的变化是抑制 4′- 羟基华法林的 CL_int。与小鼠肝脏微粒体（MLMs）相比，人源化肝脏 PXB - 小鼠 4′- 羟基华法林的清除率明显降低，7 - 羟基华法林的清除率增加，表明其代谢谱更接近人类，但仍存在小鼠来源的 CYP 活性。而 siPOR (Mm)/LNP 处理使 PXB - 小鼠 4′- 羟基华法林的清除率进一步降低，接近人类肝脏微粒体（HLMs）和 siPOR (Mm)/LNP 处理的 SCID 小鼠水平，且代谢物比例更趋向于 HLM 型。
8. siPOR (Mm)/LNP 处理的 PXB - 和 SCID 小鼠中 S - 华法林及其代谢物的 PK：研究人员测定了 PXB - 和 SCID 小鼠给予 siPOR (Mm)/LNP 或生理盐水后 S - 华法林及其代谢物的血浆浓度。结果显示，siPOR (Mm)/LNP 处理对 PXB - 小鼠 S - 华法林的药时曲线下面积（AUC）无影响，但显著降低 4′- 羟基华法林的 AUC。在 SCID 小鼠中，Por 敲低显著增加 S - 华法林的 AUC，显著降低 6 - 和 7 - 羟基华法林的 AUC。这些结果表明，siPOR (Mm)/LNP 处理改变了 S - 华法林的代谢和 PK 特征，使其更接近人类情况。

讨论

人源化肝脏小鼠在 PK/PD 和肝炎病毒研究中很有价值，但生产 100% 人肝细胞替换的嵌合小鼠难度较大，残留小鼠肝细胞的影响依然存在。RNA 干扰是抑制小鼠肝细胞基因表达的一种简单方法，LNP 作为 siRNA 的递送载体，静脉注射后在肝脏高度分布，适合用于此目的。

以 siTTR 为测试案例，研究证实了合适设计的 siRNA 可控制 PXB - 小鼠中人类和小鼠肝细胞的基因表达。不过，siTTR (Ms) 在 PXB - 小鼠中的体内敲低活性比在 SCID 小鼠中弱约 10 倍，这可能与宿主小鼠肝细胞的病理状态以及人类肝细胞的肝脂肪变性和高肝体比有关，这些因素可能影响 LNP 的摄取和 PK。除 LNP 外，配体偶联的 siRNA 也是实现特定细胞基因抑制的一种有吸引力的方法，但 GalNAc 偶联的 siRNA 制备过程比 LNP 复杂。

研究人员以 POR 为靶点，展示了利用 LNP 递送进行肝脏特异性基因表达操纵在药物研发中的应用。POR 在 CYP 介导的单加氧酶系统中至关重要，敲除 Por 基因可抑制下游 CYP 基因的活性。但 Por 基因敲除会导致小鼠胚胎致死，而肝脏特异性 Por 基因敲除的小鼠看似正常，表明致死原因可能是肝外 P450 酶缺乏电子传递。条件性 Por 基因敲除小鼠出现肝脏脂质积累和药物代谢能力下降，低表达 Por 转基因小鼠也表现出药物代谢减少。

在本研究中，确认 siPOR (Mm)/LNP 有效敲低 PXB - 小鼠肝脏中的 Por 基因后，研究人员通过检测 S - 华法林代谢来探究其对 PXB - 小鼠 PK 表型的影响。结果表明，siPOR (Mm)/LNP 处理抑制了 4′- 羟基华法林的产生，使 S - 华法林的代谢谱更接近人类，且与体内 PK 实验结果相关，说明利用 LNP 对残留小鼠肝细胞进行基因控制，有望创建更符合人类 PK 特征的模型。

与 Uehara 等人开发的小鼠 Por 条件性敲除人源化肝脏嵌合小鼠模型相比，本研究的方法无需创建新的基因工程小鼠进行交配来实现条件性敲除，通过静脉注射 LNP 包裹的 siRNA 就能轻松抑制人源化肝脏中残留小鼠肝细胞的基因表达，尤其适用于敲除致死基因的情况，且可通过一次注射 LNP 包裹的针对多个基因的 siRNA 来控制多个基因。这种方法还有助于高效利用 PXB - 小鼠，符合动物福利的 3Rs 原则。

然而，该方法也存在一些局限性。首先，siRNA 只能敲低基因表达，无法完全消除，不适合针对低表达就能维持正常表型的蛋白。其次，siRNA-LNP 介导的基因敲低持续时间通常只有几周，虽然可重复给药控制，但与基因敲除的永久删除相比，仍有一定局限性。最后，siRNA-LNP 的制备过程复杂，需要专业技术和经验，不过目前其制备过程已较为成熟，具有良好的可重复性。总体而言，本研究结果为未来利用 LNP 包裹的物种特异性 siRNA 操纵 PXB - 小鼠基因表达，创建包括疾病模型在内的新人源化模型提供了有价值的基础数据。

材料和方法

1. 寡核苷酸制备：siLuc、siTTR (Ms) 和 siTTR (Hs) 由 GeneDesign 制备。设计 16 种与 Por mRNA 完全互补、与 POR mRNA 非互补的 siRNAs，并合成 Cy3-siLuc。对 siRNAs 进行 2′- 甲氧基核苷酸化学修饰，以减少潜在免疫反应，采用标准亚磷酰胺法合成，序列和修饰情况见补充材料 Table S1。
2. LNP 配方和表征：按照之前描述的方法将各 siRNA 制备成 LNP 并进行表征。LNP 由可电离脂质 DLin-MC3-DMA、DSPC、胆固醇和 mPEG2000-DMG（50:10:38.5:1.5 mol 比）组成。用动态光散射法测定粒径和多分散指数，用 Quant-iT RiboGreen RNA 检测试剂盒测定 LNP 中总 siRNA 浓度，按公式计算封装效率（EE）。本研究中 LNP 的粒径约为 90 nm，siRNA 封装率约为 90%。
3. 细胞培养：Hep3B 和 Hepa1-6 细胞系购自美国典型培养物保藏中心，Huh-7 细胞系购自日本研究生物资源细胞库。分别用含 10% 胎牛血清（FBS）和 1× 青霉素 - 链霉素（P/S）的 E-MEM、高糖 DMEM 和低糖 DMEM 在 37°C、5% CO₂的湿润环境中培养。
4. siTTR 的体外敲低效果：在体外敲低研究中，将 1.0×10⁴个 Huh-7 或 Hepa1-6 细胞接种于 96 孔板，用 siTTR/LNP（0.003、0.01、0.03、0.1、0.3、1 或 3 nM）或生理盐水处理，孵育 24 小时后，用 TaqMan Fast Advanced Cells-to-CT Kit 收获 cDNA，进行 RT-qPCR。
5. siPOR 的体外筛选：用 Lipofectamine RNAiMAX 转染试剂将 1.0×10⁴个 Hepa1-6 细胞转染 siPORs 或 siLuc（1 和 10 nM），或仅用 Lipofectamine 试剂。孵育 24 小时后，用 RT-qPCR 定量 Por mRNA 水平。筛选出 4 种 siRNAs（SEQ03、SEQ10、SEQ13 和 SEQ15），在 Hep3B 细胞中以相同方法测试其敲低效果。
6. 小鼠饲养和护理：雄性 CB17/IcrJcl-Prkdc^scid和 CB17/Icr-Prkdc^scid/CrlCrlj（SCID）小鼠分别购自 CLEA Japan 和 The Jackson Laboratory Japan，雌性 BALB/cAnNCrlCrlj（BALB/c）小鼠购自 The Jackson Laboratory Japan。小鼠在 Eisai Co., Ltd. 的 Tsukuba 研究实验室常规条件下饲养，动物护理和实验程序经相关委员会批准，符合动物实验规定。在 PhoenixBio Co., Ltd. 进行的体内 PXB - 小鼠和 SCID 小鼠研究也经其实验室动物伦理委员会批准。
7. 嵌合小鼠（PXB - 小鼠）的制备：人肝细胞由 Lonza 提供，PhoenixBio Co., Ltd. 将其移植到小鼠体内制备 PXB - 小鼠。通过测量血液中人白蛋白含量确定替换指数（RI），大部分 PXB - 小鼠 RI 均值 ± 标准差为 90.1±6.1%（范围 70.0% - 98.8%，n = 43），用于 S - 华法林 PK 实验的 PXB - 小鼠 RI 均值 ± 标准差为 75.5±4.4%（范围 69.8% - 83.4%，n = 14）。
8. LNP 包裹的 siRNA 的生物分布：为确认 LNP 制剂是否能递送至 PXB - 小鼠肝脏，给 PXB - 小鼠静脉注射 Cy3-siLuc/LNP（0.5 mg/kg），收集肝脏、脾脏、肾脏、肺和心脏，用 Fusion FX 测定 Cy3 荧光，计算荧光值时减去生理盐水处理组的荧光值。
9. siTTR (Mm)/LNP 和 siTTR (Hs)/LNP 在 SCID 小鼠中的体内敲低效果：为确定 siTTR/LNP 的有效体内剂量，给 SCID 小鼠静脉注射 siTTR (Mm)/LNP（0.01、0.1 和 1.0 mg/kg）、siTTR (Hs)/LNP（1.0 mg/kg）或生理盐水，在给药前及给药后 1