在生命的微观世界里，细菌的奥秘一直吸引着科学家们不断探索。细菌的 DNA 甲基化作为一种重要的表观遗传修饰，其中 DNA N6 - 甲基腺嘌呤（6mA）在细菌的各种生物学过程中扮演着关键角色。然而，长期以来，用于细菌 6mA 研究的先进测序技术和分析工具十分有限。这就好比在黑暗中摸索，缺乏有效的照明工具，使得我们对细菌 6mA 的了解受到极大限制。一方面，现有的检测方法存在诸多不足，如免疫印迹和液相色谱 - 质谱（LC - MS）虽能半定量检测甲基化，但无法精准定位具体的甲基化碱基；二代测序技术如 6mA 免疫沉淀测序（6mA - IP - seq）和亚硝酸盐测序，虽分辨率有所提升，但只能识别数十个碱基对片段的甲基化模式，且严重依赖抗体或化学试剂的质量。另一方面，三代测序（TGS）技术虽取得了显著进展，如 PacBio 的单分子实时（SMRT）测序和 Oxford Nanopore Technologies（ONT）的纳米孔测序，但针对细菌 6mA 检测的相关工具仍有待系统评估和优化。在这样的背景下，为了深入了解细菌 6mA 的奥秘，香港城市大学的研究人员开展了一项全面而深入的研究。

研究人员收集了 SMRT 和七种基于纳米孔测序数据检测细菌 DNA 6mA 的工具进行评估。他们以丁香假单胞菌 pv. phaseolicola 1448A（Psph）为主要研究对象，同时对另外五种细菌菌株进行了交叉验证。通过一系列严谨的实验设计和数据分析，研究取得了一系列重要成果。

在研究方法上，研究人员首先对细菌进行培养，提取 DNA 并进行全基因组扩增（WGA）。利用纳米孔测序（使用 R9.4.1 和 R10.4.1 流动池）和 SMRT 测序对样本进行处理。针对不同工具的特点，采用相应的方法进行数据分析，如使用 minimap2 和 samtools 过滤未比对的读数，利用 SeqKit 进行统计分析等。为了评估工具性能，构建了多种数据集，并采用了多种评估指标，包括精度召回曲线（PRC）、受试者工作特征曲线（ROC）和 F1 分数等。

研究结果部分，首先是 6mA 检测的基准策略。研究人员对测序数据进行了全面的质量评估，结果显示纳米孔测序平均测序深度至少为 241×，平均读长至少为 2579 bp，SMRT 测序平均覆盖深度为 297×，且 R10.4.1 测序数据的平均 Q 分数比 R9.4.1 高 1.63 倍，为后续分析提供了可靠的数据基础。同时，根据已知的甲基转移酶（MTase）基序特异性，推导了 6mA 位点特异性的基准事实，并对不同工具的输出进行了标准化处理。

其次，在基序发现方面，研究发现 Psph 主要存在两种 6mA 基序，大多数工具在 WT 数据集上能较好地识别基序，但 Tombo_denovo 存在偏向质粒信号的问题。在 ΔhsdMSR 和 LOST 数据集上，SMRT、Dorado、Hammerhead、Nanodisco 和 Tombo_levelcom 表现出色，能准确识别基序，而 mCaller 也显示出一定的基序发现潜力。

然后是 6mA 分析的性能比较。在单核苷酸 / 5 - 聚体水平的 6mA 检测中，SMRT、Dorado 和 Tombo_levelcom 表现出较高的可靠性。在 WT 数据集中，SMRT 表现最佳，平均精度（AP）和 F1 分数分别达到 0.958 和 0.933；Dorado 的最大 F1 分数为 0.412，ROC 值为 0.992。然而，在处理 ΔhsdMSR 菌株的测序结果时，SMRT 和 Dorado 的性能有所下降，Tombo_levelcom 在低 6mA 位点丰度样本分析中表现出优势。在单分子水平，SMRT 在 WT 和 ΔhsdMSR 数据集中的 F1 分数分别为 0.955 和 0.442，Dorado 的修饰分数更为稳定。

接着是 6mA 检测准确性评估。通过设定工具特定的阈值，研究人员发现 SMRT 在单碱基分辨率的 6mA 检测中表现卓越，假阳性率低。与其他工具相比，SMRT 的异常值检测较少，且异常值与基准事实数据的交集小。同时，研究发现减去 WT 和 WGA 数据集中的共同位点可显著降低 Dorado、mCaller 和 Tombo_denovo 的假阳性率。

此外，通过与 6mA - IP - seq 结果比较，发现有 14 个甲基化位点未被三代测序工具检测到，这表明当前技术存在一定的局限性。研究还发现 R10.4.1 流动池在捕获碱基信号差异方面优于 R9.4.1 流动池，能更敏感地检测到甲基化诱导的电流差异。

针对上述结果，研究人员提出了优化方法，通过去除 WT/ΔhsdMSR 和 WGA 结果的交集，可提高工具与基准事实的重叠度，该方法显著提升了 Dorado 在单核苷酸分辨率上的性能。同时，研究发现 Dorado 在测序深度达到 50× 时，输出结果高度一致，且在 450× 时 F1 分数达到峰值。

在对五种细菌菌株的交叉验证中，研究人员评估了 SMRT、Dorado 和 Tombo_levelcom 的性能。结果显示 SMRT 能识别所有规范基序，Dorado 和 Tombo 分别检测到 9/10 和 5/10 个基序。SMRT 在单分子准确性分析中表现出色，但在大肠杆菌 K - 12 分析中性能下降。优化后的 Dorado 在所有菌株中的 F1 分数和精度分数均有所提高。

研究结论和讨论部分，该研究全面比较了 SMRT 和七种纳米孔相关计算工具在细菌 6mA 检测方面的性能，为后续工具的优化和开发提供了重要依据。研究发现目前的检测工具存在各自的局限性，如纳米孔测序受电流信号影响，难以达到单碱基分辨率；现有工具在检测低丰度甲基化位点时存在困难等。因此，建立细菌 6mA 检测的金标准至关重要。同时，研究提出的优化方法为提高 6mA 检测准确性提供了新的思路，有望推动细菌甲基化组研究的进一步发展，帮助科学家们更深入地了解细菌的表观遗传系统，为相关疾病的研究和治疗提供理论基础。