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免疫疗法中，抗 PD-1/PD-L1 疗法出现耐药问题，抗 PD-1 联合抗 LAG-3 抗体疗法应运而生，但仍有耐药现象。研究人员针对头颈癌开展研究，发现 Sox9+肿瘤细胞通过调控 Anxa1，影响 Fpr1+中性粒细胞，导致疗法耐药，为攻克耐药提供方向。
在癌症治疗的战场上，免疫疗法可谓是一颗耀眼的新星。其中，针对程序性细胞死亡蛋白 1（PD-1）及其主要配体 PD-L1 的免疫疗法，开启了现代肿瘤学的新篇章。像抑制 PD-1 的单克隆抗体（如帕博利珠单抗、纳武利尤单抗等）和靶向 PD-L1 的单克隆抗体（如阿替利珠单抗等），已获得美国食品药品监督管理局（FDA）批准并广泛应用于临床，在多种癌症治疗中展现出一定的疗效。然而，这一疗法并非十全十美，许多患者对其没有临床反应，或者在用药后产生耐药性，这使得他们无法从治疗中获益。
为了突破这一困境，越来越多的 PD-1 疗法采用联合用药策略，淋巴细胞激活基因 3（LAG-3）作为重要的免疫分子，成为与 PD-1 联合治疗策略的研究热点。抗 PD-1 和抗 LAG-3 抗体联合免疫疗法在多种癌症治疗中显示出协同抗肿瘤效果，相关药物也已获得 FDA 和欧洲药品管理局（EMA）批准。但即便如此，治疗后的耐药问题依旧存在，且对其深入研究明显不足。
中山大学附属第一医院等机构的研究人员，为了深入探究这一耐药机制，开展了一系列研究。他们利用经典的头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）小鼠模型进行研究，发现抗 PD-1 和抗 LAG-3 联合疗法比单一疗法能带来更好的生存结果。然而，部分样本对联合疗法没有响应。通过深入研究，他们发现了导致耐药的关键机制，这一研究成果发表在《Nature Communications》上，为克服联合疗法的耐药问题提供了新的方向。
研究人员在研究过程中运用了多种关键技术方法。首先是单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）技术，通过对肿瘤组织单细胞的 mRNA 测量，分析不同细胞类型的基因表达特征；其次是利用各种转基因小鼠模型，如条件敲除小鼠，来验证特定基因在体内的功能；还运用了细胞间通讯分析技术，像 CellChat 和 CellPhoneDB 分析，探究细胞间的相互作用关系。
建立联合治疗耐药小鼠癌症模型
研究人员用 4 - 硝基喹啉 1 - 氧化物（4NQO）诱导 C57BL/6 野生型小鼠患上 HNSCC，然后将小鼠随机分组进行对照 IgG、抗 PD-1、抗 LAG-3 以及抗 LAG-3 联合抗 PD-1 治疗。结果发现，LAG-3 单药治疗未提高生存率，PD-1 单药治疗显著提高生存率，联合疗法效果更优。但部分小鼠对联合疗法不敏感，根据肿瘤大小变化将小鼠分为耐药组和敏感组。通过磁共振成像（MRI）和组织病理学检查等发现，耐药组肿瘤表型更晚期，细胞增殖活跃，凋亡细胞少，而敏感组则相反。对肿瘤组织进行 scRNA-seq 分析，鉴定出 5 种主要细胞类型，且敏感组免疫细胞比例显著增加。
联合治疗耐药肿瘤细胞的特征
研究人员提取上皮细胞，利用 CopyKAT 区分恶性和非恶性细胞，确定了 19917 个非整倍体肿瘤细胞亚群，并将恶性细胞分为 5 个亚群。其中，E-resi1 和 E-resi2 亚群中耐药细胞居多，E-sens 亚群主要是敏感组细胞。通过 CellChat 分析发现，敏感组上皮细胞与免疫细胞的相互作用更强，而耐药组则较弱。进一步分析发现，ANNEXIN 信号通路在耐药组显著富集，Anxa1 在耐药细胞中高表达，其通过 Anxa1-Fpr1 轴与 Neu1 细胞（Fpr1+中性粒细胞）相互作用。
Fpr1+中性粒细胞与细胞毒性 T 细胞相关
FeaturePlot 分析显示 Fpr1 在 Neu1 细胞中高表达，免疫组化数据表明敏感组 Fpr1 蛋白水平更高。分离中性粒细胞得到 Neu1 和 Neu2 两个亚群，它们具有不同的初始细胞群体，且增殖能力无差异。免疫荧光和流式细胞术分析发现，耐药组 Fpr1+中性粒细胞数量显著低于敏感组。通过多种分析发现，Neu1 中性粒细胞与 γδT 和 Cd8 T 细胞存在显著相互作用，能促进这些细胞向肿瘤组织迁移，增强抗肿瘤免疫。在体内实验中，通过条件敲除 Anxa1 和 Fpr1 基因的小鼠模型验证了上述结论。
Anxa1-Fpr1 轴调节中性粒细胞的线粒体裂变
研究人员对分选的 Sell+中性粒细胞进行 mRNA 测序，基因集富集分析（GSEA）等发现，Anxa1-Fpr1 轴介导中性粒细胞线粒体裂变，抑制线粒体自噬（mitophagy），导致线粒体破裂和细胞凋亡，进而阻止细胞毒性 γδT 和 Cd8 T 细胞向肿瘤组织募集。
Sox9 作为 Anxa1 的转录因子介导 HNSCC 耐药
通过对 scRNA-seq 数据的深入分析，研究人员发现转录因子 Sox9 在耐药亚群和耐药组中显著富集。染色质免疫沉淀（ChIP）等实验证明，Sox9 结合到 Anxa1 启动子上，诱导 Anxa1 表达。利用多种转基因小鼠模型进一步验证，敲除 Sox9+细胞或 Sox9+细胞中的 Anxa1，能显著减少肿瘤病变，逆转 HNSCC 对联合疗法的耐药性，促进 Fpr1+中性粒细胞积累和细胞毒性 T 细胞浸润。
研究表明，在 HNSCC 中，高表达 Sox9 的上皮细胞启动 Anxa1 转录，介导 Fpr1+中性粒细胞线粒体裂变和抑制线粒体自噬，导致其凋亡，阻碍细胞毒性 Cd8 T 和 γδT 细胞迁移到肿瘤组织，从而使 HNSCC 细胞产生耐药性。这一研究全面解释了抗 LAG-3 联合抗 PD-1 疗法的耐药机制，为克服耐药提供了潜在治疗靶点，有助于推动头颈癌免疫治疗的发展，为更多患者带来希望。
