解析分枝杆菌异烟肼外排泵 MsRv1273c/72c 结构与机制：为抗结核药物设计点亮新希望

结核病（TB）治疗面临耐药难题，研究人员针对分枝杆菌 MsRv1273c/72c 展开研究。确定其为异烟肼外排泵，解析多种结构，揭示转运机制。这为抗结核药物设计提供框架，有助于开发新疗法。

　　结核病，这个古老而又顽固的疾病，每年都无情地夺走约 170 万人的生命。目前治疗结核病的主要药物，如异烟肼（INH）、利福平（RIF）、吡嗪酰胺（PZA）和乙胺丁醇（EMB），都是近 70 年前发现的。然而，随着结核分枝杆菌（Mtb）耐药性的不断出现，这些药物的疗效逐渐下降。耐药的产生，或是由于作用位点改变，或是代谢修饰酶的出现，又或是外排泵将药物排出菌体。因此，寻找新的治疗靶点和药物，深入了解耐药的分子机制，迫在眉睫。

在众多可能与耐药相关的蛋白中，ATP 结合盒（ABC）转运蛋白备受关注。这类蛋白广泛存在于各种生物中，利用 ATP 结合和水解产生的能量，运输多种底物，如小离子、脂质、肽和蛋白质等跨膜。ABC 转运蛋白由两个核苷酸结合结构域（NBDs）和两个跨膜结构域（TMDs）组成，其 NBDs 结合和水解 ATP，TMDs 促进底物转运。但 ABC 转运蛋白结构和功能多样，尚未被完全解析。

上海科技大学等研究机构的研究人员，为了解开这些谜团，针对分枝杆菌中的 MsRv1273c/72c 展开了深入研究。研究成果发表在《Nature Communications》上，为抗结核药物研发带来了新曙光。

研究人员采用了多种关键技术方法。通过蛋白质表达与纯化技术，获取研究所需的 MsRv1273c/72c 蛋白；利用冷冻电镜（cryo-EM）技术，解析蛋白在不同状态下的结构；运用 ATP 酶活性测定、脂质体转运实验等生化实验技术，探究蛋白的功能。

1. MsRv1273c/72c 的表征与功能分析

研究人员将 Rv1273c、Rv1272c、MsRv1273c 和 MsRv1272c 在耻垢分枝杆菌（Msm）细胞中串联表达并纯化。凝胶过滤和 SDS-PAGE 分析表明，它们形成 1:1 的异源二聚体。ATP 酶活性测定显示，MsRv1273c/72c 具有基础 ATP 酶活性。序列比对发现，MsRv1273c 的 NBD 存在退化位点，而 MsRv1272c 具有功能性的保守位点。突变研究进一步验证了这些位点的作用。

在底物转运研究中，运输实验表明 MsRv1273c/72c 能够运输异烟肼，且呈剂量依赖性，但不能运输乙胺丁醇。Msm 培养生长实验也证实，敲除 MsRv1273c/72c 会增加异烟肼对菌体生长的抑制，而互补菌株则消除了这种差异，表明 MsRv1273c/72c 参与异烟肼耐药。

2. MsRv1273c/72c 的结构解析

研究人员通过冷冻电镜技术，解析了 MsRv1273c/72c 在多种状态下的结构。在 IF^apo状态下，中央腔向细胞质开放，两个 NBD 在 NBS 处分离，但 C 末端螺旋相互作用。MsRv1272c 具有两个独特的结构特征：N 末端延伸环插入底物结合腔，可能有助于底物进入；周质螺旋发夹结构覆盖底物结合腔出口，可能有助于底物释放。

在 ATP 结合的 Occ 状态下，中央腔在细胞质和周质两侧均被封闭，N 末端延伸环被挤出，两个 NBD 完全闭合，ATP 夹在二聚体界面的保守和退化 NBS 处。

在 AMPPNP 结合的 IF^asym-1状态下，中央腔仍向细胞质开放，延伸环插入，但 NBDs 在退化位点部分二聚化，在保守位点存在间隙，AMPPNP 在退化位点结合较弱。

在 ADP 结合的 IF^asym-3状态下，ADP 结合在保守位点，退化位点无核苷酸，NBDs 部分二聚化，且与 IF^asym-1状态构象不同。

在 ATP|ADP 结合的 IF^asym-2状态下，NBDs 在退化位点部分二聚化，保守位点结合 ADP，退化位点结合 ATP，该状态可能代表 IF 和 Occ 之间的中间状态。

3. 不同状态间的构象变化

通过比较不同状态下 MsRv1273c/72c 的结构，研究人员发现，在 NBD 闭合过程中，两个 CpHs 相互靠近，中央腔开闭。MsRv1272c 的 D-WalkerB 环和 X-signature 环发生构象变化，调节和偶联保守和退化 NBS 的功能。在 IF^apo状态下，D-WalkerB 环呈 L 形，保守 NBS 扭曲；在中间状态，部分二聚化触发 D-WalkerB 环转变为 S 形，激活保守 NBS。X-signature 环在不同状态下的位置变化，影响退化位点与 ATP 的结合。

研究结论和讨论部分指出，MsRv1273c/72c 的结构存在不对称性，MsRv1272c 的延伸环和螺旋发夹结构可能在底物转运中发挥重要作用。研究中未捕获到 OF 状态，表明该转运体在 Occ 状态更稳定。IF^asym状态可能是转运过程中的关键中间构象，有助于解释存在退化位点时的构象转变。基于这些结构，研究人员提出了 MsRv1273c/72c 的转运机制模型，包括底物进入、ATP 结合与 NBD 二聚化、中央腔闭合、底物释放、ATP 水解、NBD 分离等步骤，可能还存在一个高效的小循环。

此外，Rv1273c/72c 在结核分枝杆菌细胞壁脂质构建中发挥重要作用，可能运输细胞壁脂质前体。MsRv1273c/72c 与 Mtb Rv1273c/72c 序列相似度高，其结构为抗结核药物设计提供了精确模板，可针对其独特结构特征开发特异性抑制剂，有望推动抗结核新药的研发。