O - 岩藻糖基转移酶 SPINDLY 调控拟南芥果实生长机制揭秘

在植物果实发育研究中，生长素（auxin）虽对果实起始和生长至关重要，但 ARF6 和 ARF8 介导的果实生长受何种翻译后修饰调控尚不明确。杜克大学研究人员开展 O - 岩藻糖基转移酶 SPINDLY 相关研究，发现其可减弱生长素诱导的果实生长，为作物研究提供理论依据。

　　在繁花盛开的植物世界里，果实的发育是一场神奇的旅程。植物激素在其中扮演着关键角色，尤其是生长素，它如同一位 “指挥家”，在受精后对果实的起始和生长起着至关重要的促进作用。通过基因突变或外源生长素处理来上调生长素信号，能诱导未授粉的子房发育成无籽果实，这一现象被称为单性结实（parthenocarpy） 。无籽果实不仅深受消费者喜爱，还具有延长保质期、改善风味等优点，在应对高温等不利环境时，能保证更稳定的产量。

然而，在这看似清晰的调控路径中，仍存在许多未解之谜。就像隐藏在迷雾中的宝藏，等待着科学家去探索。此前研究表明，拟南芥中的 A 类生长素响应因子 6（ARF6）和 ARF8 在果实发育过程中具有双重功能，授粉前它们与未知的核心抑制因子 IAA 蛋白结合，抑制果实起始；受精后则作为 ARF 二聚体促进果实生长。但令人困惑的是，翻译后修饰（PTMs）是否以及如何调控 ARF6 和 ARF8 介导的果实生长，这一关键问题一直未得到解答。为了揭开这层神秘的面纱，探索果实发育调控的深层机制，来自美国杜克大学（Duke University）的研究人员踏上了探索之旅，他们的研究成果发表在《Nature Communications》杂志上。

研究人员为了深入探究这一问题，运用了多种先进的技术方法。在基因功能研究方面，通过构建各种突变体和转基因植株，观察其表型变化，分析基因之间的相互作用。比如构建 spy、arf6、arf8 等单突变体以及双突变体、三突变体，研究它们在果实生长过程中的表现。同时，利用 RNA 测序（RNA-seq）技术，全面分析不同突变体和野生型在果实发育不同阶段的基因表达谱，筛选出与 ARF6、ARF8 和 SPINDLY 相关的差异表达基因。在蛋白质水平的研究中，运用共免疫沉淀（co-IP）技术，检测蛋白质之间的相互作用，确定 SPINDLY 对 ARF6/8 与其他蛋白结合的影响。还通过质谱分析（MS）鉴定 ARF6 和 ARF8 的 O - 岩藻糖基化位点。

研究结果如下：

1. spy 突变体表现出单性结实果实生长：遗传和蛋白质组学分析表明，SPINDLY 催化的蛋白质 O - 岩藻糖基化在拟南芥发育过程中发挥着重要作用，但具体分子机制大多未知。研究人员对四个 spy 等位基因进行研究，发现所有突变体的去雄花雌蕊都比野生型更长，这表明核定位的 SPY 在授粉前抑制果实起始和伸长。同时，通过蛋白质印迹分析发现，SPY 蛋白水平在开花后降低，且 spy-3 突变体在开花后蛋白质 O - 岩藻糖基化水平也降低。
2. arf6 与 spy 表现出累加相互作用，而 arf8 在单性结实伸长中对 spy 上位：arf6 和 arf8 突变体去雄后果实比野生型更长更宽，且 arf8 的单性结实生长更强。通过对 spy-3、arf6-2 和 arf8-3 进行上位性分析，发现 spy 和 arf6 在单性结实果实伸长中具有累加作用，而 spy arf8 双突变体与 arf8 单突变体果实长度相似，表明 arf8 在单性结实果实伸长中对 spy 上位。此外，研究还发现 ARF8 在介导生长素诱导的单性结实生长中比 ARF6 发挥更重要的作用。
3. ARF6 和 ARF8 被 SPINDLY 进行 O - 岩藻糖基化修饰：基于遗传相互作用，研究人员通过在烟草（Nicotiana benthamiana）中瞬时共表达实验以及在拟南芥转基因植株中的验证，发现 ARF6 和 ARF8 是 SPINDLY 的直接靶标，且它们的 O - 岩藻糖基化修饰主要发生在中间区域（MR）。通过质谱分析鉴定出了 ARF6 和 ARF8 的 O - 岩藻糖基化位点，并且发现除了 O - 岩藻糖基化，ARF6 和 ARF8 还存在磷酸化和 O - 连接 - N - 乙酰葡糖胺（O-GlcNAc）修饰，但 O-GlcNAcylation 在果实发育过程中对 ARF6/8 的功能影响不显著。
4. SPY 和 ARF6/8 在果实形成过程中调控许多共同靶基因：通过 RNA-seq 分析，研究人员鉴定出了 ARF6、ARF8 和 SPINDLY 响应的基因，发现 67% 的 SPY 差异表达基因（DEGs）受 ARF6 和 / 或 ARF8 共同调控，且这些共同调控的基因与受精响应基因有显著重叠。GO 分析表明，这些基因参与多种生物学过程，如对糖、脂肪酸、营养物质和激素的响应等。通过 RT-qPCR 和 ChIP-qPCR 实验进一步验证了部分靶基因，证明它们是 ARF6 和 ARF8 的直接靶基因。
5. SPY 不影响 ARF6 或 ARF8 的 DNA 结合、蛋白质稳定性或核定位：研究人员通过 ChIP-qPCR 实验发现，SPY 突变不影响 ARF6/8 与靶启动子的结合；通过免疫印迹分析表明，ARF6 和 ARF8 蛋白在野生型和 spy 背景下积累水平相似；通过共聚焦荧光显微镜观察发现，ARF6-GFP 仅在细胞核中检测到，ARF8-GFP 在根尖细胞核中微弱检测到，说明 SPY 不影响 ARF6/8 的核定位。
6. SPY 增强 IAA9-ARF6/8 转录抑制，但降低 ARF6/8 反式激活活性：研究人员通过双荧光素酶（LUC）报告基因实验发现，SPY 能减弱 ARF6/8 的反式激活活性，同时增强 IAA9-ARF6/8 复合物的转录抑制活性。进一步研究发现，ARF6/ARF8 的异源二聚体与同源二聚体在诱导转录方面没有显著差异。
7. SPY 减少 ARF6/ARF8 与 Mediator 8 的相互作用：研究人员通过酵母双杂交（Y2H）实验、共免疫沉淀实验发现，ARF6 和 ARF8 与 Mediator 复合物的亚基 MED8 相互作用，且 SPY 介导的 O - 岩藻糖基化修饰会减少 ARF6/8 与 MED8 的结合。在拟南芥中，spy 突变增强了 MED8 与 ARF6 的相互作用，表明 O - 岩藻糖基化修饰降低了它们在植物体内的结合亲和力。同时，研究还发现 med8 突变体在去雄后雌蕊比野生型更长，而 spy med8 双突变体雌蕊长度与野生型相似，说明 med8 在单性结实雌蕊生长中对 spy 上位。

研究结论和讨论部分指出，SPY 通过对 ARF6/8、IAA9 和 MED8 进行 O - 岩藻糖基化修饰，抑制生长素诱导的果实生长。在授粉前，低生长素水平下，SPY 介导的 O - 岩藻糖基化修饰减少 ARF-MED8 相互作用，增强 ARF6/8-IAA9 复合物的转录抑制活性，从而抑制果实起始；授粉后，高生长素水平触发 IAA9 降解，释放 ARF6 和 ARF8，它们与 MED8 结合激活果实生长相关基因的表达。此外，SPY 蛋白水平和活性在授粉后降低，进一步增强 ARF6/8 的反式激活活性。这项研究揭示了 SPY 介导的 O - 岩藻糖基化修饰在调控生长素诱导的果实生长中的重要作用，为深入理解植物果实发育的分子机制提供了新的视角，也为培育适应气候变化的作物品种提供了理论基础。未来研究可以进一步探究该调控模块在不同植物物种中的保守性，以及如何利用这些发现来优化作物育种策略，提高作物产量和品质。