突破认知：C 类 β- 内酰胺酶 ADC-1 碳青霉烯酶活性的进化及其重大警示

本文聚焦 C 类 β- 内酰胺酶 ADC-1 碳青霉烯酶活性的进化研究。通过筛选 ADC-1 突变体，发现三个氨基酸替换可使其对碳青霉烯类抗生素产生高水平耐药。从酶动力学、结构、分子对接和 MD 模拟多方面解析其耐药机制，为应对细菌耐药提供关键依据。

　　

引言

抗生素的发现与应用为感染性疾病治疗带来变革，但细菌耐药问题日益严峻。碳青霉烯类抗生素作为 β- 内酰胺类的重要成员，常用于治疗多重耐药菌感染，然而耐药菌的出现严重限制了其疗效。

细菌对碳青霉烯类抗生素耐药的机制多样，包括抗生素作用靶点改变、药物外排增加、膜孔蛋白修饰或缺失导致药物渗透减少等，其中产生碳青霉烯酶（carbapenemases）是最主要的耐药机制。β- 内酰胺酶分为 A、B、C、D 四类，A、B、D 类中的多种酶可使细菌对碳青霉烯类抗生素产生高水平耐药，而 C 类 β- 内酰胺酶通常被认为难以进化出此类耐药性。

鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）是受碳青霉烯酶广泛传播影响的重要病原菌之一，碳青霉烯耐药鲍曼不动杆菌（CRAb）被美国疾病控制与预防中心和世界卫生组织列为对公共卫生威胁最高的病原体，常引发多种医院感染，且多数 CRAb 菌株对其他常用药物也耐药，死亡率可高达 85%。在 COVID-19 大流行期间，医院内 CRAb 感染发生率惊人地增加了 78%。在鲍曼不动杆菌中，D 类酶在碳青霉烯耐药中起主导作用，B 类锌金属酶和 A 类碳青霉烯酶相对较少见。

2014 年有研究报道，β- 内酰胺酶 ADC-68 可使鲍曼不动杆菌临床分离株对碳青霉烯类抗生素产生耐药性。ADC-68 是一类由不动杆菌染色体编码的 C 类头孢菌素酶（ADCs）的代表，目前已报道有超过 350 种变体。这些酶可使细菌对青霉素、窄谱和广谱头孢菌素以及单环 β- 内酰胺类抗生素产生耐药。ADC-68 与非碳青霉烯酶 ADC-1 相比有七个氨基酸替换，且是目前唯一已知能单独赋予碳青霉烯耐药性的 C 类酶，但这些替换在碳青霉烯酶活性中的作用尚未明确。本研究旨在探究 ADC 酶的进化途径，明确产生碳青霉烯酶活性所需的氨基酸替换数量，并对 ADC-1 的三重突变体（ADC-1_TM）的耐药机制进行研究。

结果与讨论

1. ADC-1 突变体的筛选及对 β- 内酰胺类抗生素耐药性和细菌生长的影响

由于鲍曼不动杆菌菌株编码固有 D 类 β- 内酰胺酶 OXA-51，该酶单突变即可获得高水平碳青霉烯酶活性，因此研究人员在表达 ADC-1 的大肠杆菌 DH5α 中筛选碳青霉烯耐药突变体。在含亚胺培南的培养基中筛选未成功，而在含厄他培南且浓度逐渐增加的培养基中连续传代，最终获得了含有 Val292Phe、Ser318Thr 和 Phe322Ser 替换的 ADC-1_TM突变体。该突变体对厄他培南的最低抑菌浓度（MIC）比亲本酶高 64 倍。

将携带 bla_ADC-1TM基因的穿梭载体导入鲍曼不动杆菌 ATCC 17978 进行进一步研究。单独及组合引入这三个替换，结果显示表达 ADC-1_TM的菌株对美罗培南、多尼培南和厄他培南的 MIC 显著升高，表明这三个替换以累加方式增加了对这些碳青霉烯类抗生素的耐药性，从而产生高水平耐药。其中，Val292Phe 替换对厄他培南 MIC 的影响最大。此外，研究人员在超过 350 个已报道的 ADC β- 内酰胺酶序列中搜索这三个替换，发现 Ser318Thr 在三个临床分离株（ADC-145、ADC-200 和 ADC-256）中存在。虽然像 ADC-1_TM这种需要三个氨基酸替换的突变体在临床上是否会出现仍有待观察，但鲍曼不动杆菌中固有 D 类 β- 内酰胺酶 OXA-51 的存在可能会降低选择压力，阻碍 ADC-1 碳青霉烯酶活性的进化。

研究还监测了表达 ADC-1 或 ADC-1_TM的鲍曼不动杆菌的生长速率，发现二者非常相似，说明这三个导致碳青霉烯酶耐药的突变对细菌生长无显著影响。

此前报道 ADC-68 β- 内酰胺酶可产生碳青霉烯耐药性，为比较 ADC-1_TM与 ADC-68 的耐药水平，研究人员将编码 ADC-68 的基因克隆到穿梭载体并在鲍曼不动杆菌 ATCC 17978 中表达。令人惊讶的是，检测的四种碳青霉烯类抗生素的 MIC 均未增加，但 ADC-68 对氨苄西林的 MIC 比之前报道高 16 倍，比 ADC-1 高 2 倍，表明该酶有活性且在载体中高表达。综合数据表明，ADC-1_TM对美罗培南、厄他培南和多尼培南产生高水平耐药，而在相同条件下，ADC-68 未检测到碳青霉烯耐药性。

2. 酶动力学

研究人员评估了 ADC-1 和 ADC-1_TM的稳态动力学参数 k_cat和 K_m。对于美罗培南、厄他培南和多尼培南，ADC-1_TM的 k_cat值分别比 ADC-1 增加了 41 倍、86 倍和 18 倍，而 K_m值对于美罗培南和多尼培南分别降低了近 4 倍和 6 倍，对于厄他培南则低于检测限（≤1 μM）。这些结果表明，ADC-1_TM中的氨基酸替换不仅提高了周转速率，还增强了对这些碳青霉烯类抗生素的表观结合亲和力，且对周转速率的影响更大。美罗培南和多尼培南的 k_cat/K_m值分别增加了 158 倍和约 110 倍，厄他培南基于 K_m上限计算的 k_cat/K_m值增加了 86 倍，这反映出 ADC-1_TM对这些碳青霉烯类抗生素具有更高的催化效率，与临床相关的耐药水平一致。对于亚胺培南，ADC-1_TM的 k_cat值变化很小，K_m值仅能测量上限（≤1 μM）。

为深入了解 ADC-1_TM的动力学，研究人员评估了酰化（k₂）和脱酰化（k₃）的速率常数。选择厄他培南进行实验，因为 ADC-1_TM对其 k_cat值增加最多。在单周转条件下，ADC-1 和 ADC-1_TM被厄他培南酰化的反应呈双相，一半反应在数秒内完成，另一半在数分钟内完成，这种现象此前在一些 A 类和 D 类酶中报道过，但在 C 类 β- 内酰胺酶中未出现。ADC-1_TM的快相酰化速率（k_{2 fast}）比 ADC-1 至少高 62 倍，慢相酰化速率（k_{2 slow}）高 3.6 倍。

在测量脱酰化速率常数 k₃时，使用 100 倍推荐稀释法对 ADC-1 和 ADC-1_TM进行实验，发现速率低于预期且非线性，无法用该方法确定 k₃。对于 ADC-1，通过 k₃ = (k_cat × k₂)/(k₂ - k_cat) 计算得出 k₃值为 0.00037 s^-1，与 k_cat相同，表明脱酰化是 ADC-1 催化厄他培南周转的限速步骤。而对于 ADC-1_TM，使用 k_{2 fast}和 k_{2 slow}计算出的 k₃值不同（分别为 0.032 s^-1和 0.13 s^-1），无法明确反应的限速步骤。通过 20 倍稀释重新测量，得到 k₃值为 0.063 ± 0.001 s^-1，大于 k_cat值，说明与 ADC-1 不同，ADC-1_TM催化厄他培南的限速步骤是慢相酰化。

研究人员还评估了 ADC-68 的稳态动力学。对于氨苄西林，ADC-68 的 k_cat比 ADC-1 仅降低 1.5 倍，K_m值仅能确定上限（≤5 μM），其催化效率高于亲本酶，与本研究中氨苄西林的 MIC 结果相符，且比文献报道的催化效率至少高 1.9 倍，表明该酶比文献描述的更具活性。对于美罗培南、多尼培南和亚胺培南，ADC-68 的 k_cat值比 ADC-1 增加约 3 - 8 倍，K_m值相近或增加 4.5 倍，催化效率仅略有增加（约 2 - 4 倍）。对于厄他培南，由于 ADC-1 的 K_m值仅能确定上限，无法明确比较二者活性。与 ADC-1_TM相比，ADC-68 对美罗培南、厄他培南和多尼培南的 k_cat值分别低 5 倍、2.9 倍和 6.7 倍，K_m值分别增加 17 倍、约 3.5 倍和约 6 倍，催化效率分别低 89 倍、约 9.7 倍和约 40 倍。对于亚胺培南，ADC-68 的 k_cat值比 ADC-1_TM高 6 倍，但由于 ADC-1_TM的 K_m值仅能确定上限，无法明确比较二者催化效率。总体而言，ADC-68 的碳青霉烯酶活性略高于 ADC-1，但远低于 ADC-1_TM，研究数据与之前报道不符，表明 ADC-68 缺乏强效碳青霉烯酶活性，无法在鲍曼不动杆菌中产生临床水平的耐药性。

3. 结构研究

ADC-1 和 ADC-1_TM的晶体结构与先前报道的 ADC-1 结构（PDB 代码 4NET）同构，在不对称单元中均为二聚体。将 ADC-1 和 ADC-1_TM二聚体与 4NET 叠加，发现三者在整体结构上无重大差异，但在 Ω-loop（二级结构编号中的 B5a 和 B5b 链以及 A7a 螺旋）和 B8 - B9 链之间的环存在局部差异。

在两种酶的单体 A 中，Ω-loop 均呈 β- 发夹样构象，但 B8 - B9 环的构象差异较大。在 ADC-1 中，该环向活性位点外弯曲，而在 ADC-1_TM中则明显向内折叠。在单体 B 中，二者的 B8 - B9 环构象相似但位置相差约 1.4 ?，这是由于 ADC-1_TM中 Phe322Ser 替换，较小的丝氨酸侧链导致 Arg321 主链重排，其侧链方向改变并与 Ω-loop 的 Asn204 和 Gln207 形成氢键，使 ADC-1_TM中该环相对 ADC-1 更稳定（ADC-1_TM有 4 个残基无序，ADC-1 有 13 个残基无序）。B8 - B9 环和 Ω-loop 靠近催化丝氨酸（Ser64）和活性位点，其构象变化可能影响底物结合和 / 或催化。

ADC-1 - 厄他培南酰化酶复合物的晶体结构显示，不对称单元中的两个单体存在明显二态性。在单体 A 中，厄他培南的核心部分清晰可辨，吡咯啉环呈 Δ²互变异构体构象，其 O7 羰基氧远离由 Ser64 和 Ser318 主链酰胺氮原子形成的氧阴离子孔，与 Lys67 形成氢键，这可能阻止脱酰化，类似 AmpC - 亚胺培南复合物的情况。在单体 B 中，吡咯啉环呈 Δ¹R 互变异构体形式，C7 羰基以典型构象结合在氧阴离子孔中，与 Ser64 和 Ser318 形成氢键。活性位点中存在一个潜在的脱酰化水分子，距离厄他培南的 C7 原子约 3.9 ?，但该水分子与厄他培南的两个原子（N4 和 O31）形成氢键，可能影响其活化并阻碍其接近 C7 原子，加上 Δ¹R 互变异构体构型的厄他培南更耐水解，可能导致该复合物的脱酰化效率较低。若溶液中同时存在单体 A 和 B，可能只有单体 B 对动力学检测到的厄他培南极慢脱酰化有贡献。

4. 分子对接

由于 ADC-1_TM与厄他培南的浸泡实验未捕获到酰化酶复合物，研究人员进行分子对接生成复合物模型。测试了酰化碳青霉烯的三种不同互变异构体状态（Δ¹R、Δ¹S 和 Δ²）在每个单体中的对接情况，模拟过程中允许 Phe292 和 Thr318 的侧链灵活变化。在单体 A 中，Δ²互变异构体的对接分数始终最高，且其 O7 羰基氧指向氧阴离子孔，与 ADC-1 - 厄他培南晶体结构中单体 A 的情况相反。对接构象中，厄他培南的核心部分相对于晶体结构发生明显位移，吡咯啉环旋转约 60° 并向远离 B8 链方向平移约 4 ?，这是由于 ADC-1_TM中 B8 - B9 环构象变化，使 Thr318（三个突变之一）侧链占据了 ADC-1 中 C3 羧酸盐的位置，导致 ADC-1 - 厄他培南复合物单体 A 中观察到的氢键相互作用在对接构象中均未保留。

在单体 B 中，厄他培南仅在 Δ¹R 互变异构体状态下对接分数最高，且 O7 羰基位于氧阴离子孔中。厄他培南存在两种能量大致相等的取向（ertaB1 和 ertaB2），与 ADC-1 - 厄他培南晶体结构中单体 B 的构象均不同。这两种取向的转换由 Phe292 侧链从 t80 旋转异构体向更有利的 m - 85 旋转异构体的旋转促进，使整个厄他培南分子旋转近 180°。

虽然单体 A 中 C7 羰基重新定位到氧阴离子孔的构象类似于更典型的酰基键构象，可能导致 ADC-1_TM脱酰化速率增强，但为测试对接复合物的稳定性和可行性，深入了解两种单体中酰化酶中间体的重排如何导致突变体动力学改变，研究人员进行了分子动力学（MD）模拟。

5. MD 模拟

对对接得到的 ADC-1_TM - 厄他培南模型的两个单体（ADC-1_TM - ertaA、ADC-1_TM - ertaB1 和 ADC-1_TM - ertaB2）进行了三次 100 ns 的 MD 模拟，并对 ADC-1 - 厄他培南晶体结构的单体（ADC-1 - ertaA 和 ADC-1 - ertaB）进行类似模拟作为对照。所有复合物的蛋白质主链相对于初始模型的均方根偏差在 1.5 - 2.0 ? 之间，表明模拟稳定。

对于脱酰化过程，水分子必须