探究抗药大肠杆菌体外生物膜形成能力与在无菌生菜上持续生存的关联：对食品安全的重要意义

本文研究了 174 株来自新鲜农产品及其生产环境的大肠杆菌（Escherichia coli）。测试其体外生物膜形成能力，并选取部分耐药菌株接种无菌生菜（Valerianella locusta）。结果发现体外生物膜形成能力与在生菜叶上的生存无明显关联，但所有菌株都能持续存活 21 天以上，存在食品安全风险。

　　

引言

新鲜农产品是健康饮食的重要组成部分，但易被有害病原体污染，引发疾病和食源性疾病暴发。其中，新鲜叶菜类在 1980 - 2016 年相关疫情中占比超半数，涉及近 73000 例感染和 173 例死亡。除了病原体，抗生素抗性细菌（ARB）也常污染农产品，其携带的抗生素抗性基因（AGRs）对全球健康和食品安全构成威胁。蔬菜及最低限度加工食品被认为是人类肠道微生物群中 AGRs 的主要来源，人们通过食用受污染生菜可能接触到抗性大肠杆菌（Escherichia coli）。

细菌在植物叶际环境中的生存与多种因素有关，生物膜形成是细菌在环境中生存的重要策略。生物膜由细菌分泌的多糖、蛋白质和细胞外 DNA 等组成，能保护细菌抵御外界压力，如紫外线辐射、抗菌剂和植物免疫系统等。目前研究多集中在致病菌株的生物膜形成，对环境中 ARB 菌株在植物叶上的生物膜形成研究较少。本研究旨在探究环境中大肠杆菌体外生物膜形成能力与在无菌生菜叶际环境中生存和定植的相关性。

材料和方法

1. 菌株来源和特征：研究选取 174 株来自瑞士市场或生产地新鲜农产品（35 株）、生产环境（土壤 20 株、灌溉水 117 株、温室喷头 2 株）的大肠杆菌，测试其体外生物膜形成能力。通过纸片扩散法测定这些菌株对 32 种抗生素的抗性，覆盖 14 类抗生素，计算多药耐药（MAR）指数，并确定部分菌株的系统发育群。用于植物体内实验的 11 株大肠杆菌，依据体外生物膜形成能力、抗生素抗性谱和分离来源多样性进行选择。
2. 培养基和细菌培养：实验使用多种培养基，如用于过夜培养的溶原肉汤（LB），用于晶体紫（CV）实验的 LB - NaCl (5)、LB - NaCl (0) 和 AB 基本培养基添加 0.5% 酪蛋白氨基酸（ABTCAA）等。选择性培养大肠杆菌使用 CHROMagar E. coli（CrA），添加不同抗生素用于筛选抗性菌株。
3. CV 实验：采用 96 孔板系统进行 CV 实验，以定量测定体外生物膜形成能力。实验设置 4 个技术重复，独立重复 3 次，同时设置强弱生物膜形成对照菌株和未接种培养基的阴性对照。菌株在 LB - NaCl (5) 中过夜培养后，稀释至 LB - NaCl (0) 或 ABTCAA 中，在特定条件下培养 48 小时，经过染色、洗涤等步骤后，测定 600nm 处光密度（OD₆₀₀）。根据 OD₆₀₀值与阴性对照的关系，将菌株分为无 / 弱、中等、强和极端生物膜形成四类。
4. 无菌植物系统
   • 种子灭菌：以生菜（V. locusta）建立无菌植物生长系统，种子依次用蒸馏水、乙醇、次氯酸钠溶液处理，再用蒸馏水清洗，干燥后在 10°C 黑暗中分层 7 天。
   • 种子发芽和种植：无菌种子在专用滤纸中发芽，转移至含有半强度 Murashige - Skoog（MS）琼脂的塑料盒中继续培养 21 天。
   • 接种和收获：从 CrA 平板挑取单菌落，制备菌悬液并调整浓度至 OD₆₀₀为 0.05 ± 0.005，接种到生菜植株上。在接种后 3、7、14 和 21 天收获植株，通过平板计数和 qPCR 测定细菌数量。
   
   
5. 荧光显微镜：使用 LIVE/DEAD BacLight Kit L7007 染料对叶片上的细菌细胞进行染色，在荧光显微镜下观察不同时间点的细菌生长情况，记录图像并进行处理。
6. 定量 PCR（qPCR）：为避免死细胞对细菌计数的影响，采用碘化丙啶单叠氮化物（PMA）处理样本，通过 qPCR 定量测定活大肠杆菌数量，以yccT基因作为大肠杆菌特异性靶标，构建标准曲线进行定量。
7. 数据分析和统计：使用 R 软件进行数据分析和统计，对体外生物膜形成数据进行 log₂转换，进行配对 t 检验、线性混合效应（LME）回归分析等。对植物体内实验数据进行 log₁₀转换，使用广义最小二乘法（GLS）模型分析不同因素对yccT基因拷贝数的影响。

结果

1. 大肠杆菌体外生物膜形成
   • 培养基类型影响生物膜形成：培养基类型对生物膜形成有影响，但作用较小。在 LB - NaCl (0) 中，菌株的 OD₆₀₀值比 ABTCAA 高 1.4 倍，部分菌株生物膜类型因培养基不同而改变。总体而言，两种培养基中生物膜形成能力呈强相关（Pearson’s r = 0.71）。
   • 平均体外生物膜形成与分离来源和系统发育群弱相关：不同分离来源的菌株体外生物膜形成能力略有差异，新鲜农产品来源的菌株在 LB - NaCl (0) 中的平均 OD₆₀₀值低于土壤或水来源的菌株。部分系统发育群的菌株在不同培养基中的生物膜形成能力存在显著差异，如 A 群与 B1、F 群。
   
   
2. 不同生物膜类型的抗药大肠杆菌在植物体内的持续生存
   • 菌株特征：选取的 11 株菌株代表常见的大肠杆菌系统发育群，涵盖不同生物膜形成类型，均为多药耐药菌株，最高 MAR 指数达 0.66，最低为 0.09，但体外生物膜形成与 MAR 无强相关。
   • CFU 计数与yccT拷贝数高度相关：尽管生物膜形成可能影响平板计数准确性，但本研究中 CFU 计数与yccT拷贝数之间存在强相关（Pearson’s r = 0.89），后续数据分析主要基于 qPCR 数据。
   • 体外生物膜形成不影响植物体内细菌种群密度：体外生物膜形成能力与植物体内细菌种群密度差异无关，差异主要取决于体外生物膜形成能力与时间的相互作用，仅在接种后 21 天部分菌株存在差异。同时，MAR 对种群密度的预测作用也较低。
   • 植物体内两个亚群随时间区分：对于中等、强和极端生物膜形成菌株，植物体内种群密度的分散性随时间增加，呈现双峰分布，可通过混合高斯分布模型拟合。
   • 大肠杆菌在生菜叶上形成长聚集体：荧光显微镜观察显示，不同生物膜类型的菌株在生菜叶上的定植效率和持续性无显著差异，但存在不同的定植类型，有的形成长聚集体，有的以单细胞或小菌落结构存在。
   
   

讨论

生物膜形成是细菌在环境中生存的常见策略，但体外生物膜模型结果与体内情况常存在差异。本研究中，生长培养基类型影响超半数环境大肠杆菌的体外生物膜形成能力，且这种影响具有菌株依赖性。分离来源和系统发育群也与体外生物膜形成能力相关，但在植物定植过程中未体现出优势。

从食品安全角度看，多药耐药大肠杆菌在新鲜农产品叶际环境中的持续存在至关重要。本研究中多数菌株 MAR 指数超 0.2，表明可能来源于高风险抗生素使用环境。尽管体外生物膜形成能力与在无菌生菜上的定植和生存无关，但所有菌株都能在植物上持续存活至少 21 天，部分菌株种群密度甚至增加。这与以往研究中大肠杆菌在植物叶上随时间减少的结果不同，可能与检测方法的灵敏度有关。

此外，本研究未发现体外生物膜形成菌株在叶片上的生存优势，且观察到的种群密度分布不能用简单的正态或对数正态分布解释，而更适合用混合正态分布描述，其原因尚待进一步研究。总之，本研究凸显了环境中抗药大肠杆菌生物膜形成的复杂性，体内验证对预测潜在健康风险至关重要，后续需深入研究大肠杆菌在植物表面的种群动态和分布模式，以完善对生物膜动力学及其对食品安全影响的认识。