肉桂醛：对抗微生物腐蚀的绿色新希望 —— 有效破坏普通脱硫弧菌生物膜

微生物影响的腐蚀（MIC）严重困扰各行业，硫酸盐还原菌（SRB）是主因。本文研究发现，肉桂醛对普通脱硫弧菌（Desulfovibrio vulgaris）生物膜有显著破坏作用，效果与戊二醛相当，有望成为环保替代品，助力缓解 MIC 问题。

　　

微生物影响的腐蚀（MIC）与研究背景

微生物影响的腐蚀是一个严重影响众多工业领域的电化学过程。在石油化工、油气、水处理以及航空和国防等行业，金属设备因微生物的作用而加速腐蚀，造成巨大的经济损失。据统计，在油气行业，MIC 造成的损失可占年度全球腐蚀总损失的 20% 。

硫酸盐还原菌（SRB）是导致 MIC 的关键微生物，尤其在缺氧环境中，如油气管道。它们通过代谢产生硫化氢（H₂S），H₂S 与金属离子反应生成硫化亚铁（FeS），不仅会造成管道堵塞，还会加速金属腐蚀。此外，部分 SRB 还能产生有机酸，进一步酸化环境，加剧腐蚀程度。

普通脱硫弧菌（Desulfovibrio vulgaris）作为 SRB 的典型代表，常被用作研究 SRB 能量代谢和腐蚀影响的模式微生物。它具有形成生物膜的能力，生物膜能为 SRB 提供适宜的生存环境，增强其对外部压力的耐受性，从而加速金属腐蚀。

目前，常用的防止 MIC 的方法是使用生物杀灭剂，如戊二醛。戊二醛虽具有广谱抗菌活性，但对水生生物有毒，且处理成本高昂。因此，开发环保、有效的替代方法迫在眉睫。植物提取物中的天然化合物因具有生物可降解性，成为潜在的候选者。肉桂醛作为一种天然生物活性化合物，不仅具有抗菌、抗真菌等多种特性，还被报道可作为腐蚀抑制剂，在酸性环境中能在金属表面形成保护膜，抑制腐蚀。然而，其对参与微生物腐蚀的细菌，尤其是 SRB 的作用研究较少。本研究旨在探究肉桂醛对普通脱硫弧菌生物膜的作用，并与戊二醛进行比较，评估其作为环保替代品缓解 MIC 的潜力。

材料与方法

1. 细菌菌株与培养条件：实验选用普通脱硫弧菌希尔德堡菌株 ATCC 29579（DSM 644），从德国莱布尼茨研究所 DSMZ 获得。在 Hungate 管中，以改良的 Desulfovibrio（Postgate）培养基进行厌氧培养。培养基中 FeSO₄×7H₂O 浓度从 0.5g/L 降至 0.02g/L，以减少 FeS 沉淀。培养前，用 N₂吹扫去除溶解氧，然后高压灭菌。固体培养基则添加 15g/L 琼脂后灭菌。培养过程在标准缺氧环境中，37°C 下进行 48 - 72h，使用 BD GasPak EZ Standard Incubation Container 和配套的指示剂系统，所有操作均在手套箱内进行，以控制氧气浓度。菌株保存为 15% 甘油悬浮液，置于 - 80°C。
2. 最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC）的测定：采用肉汤稀释法测定肉桂醛和戊二醛的 MIC，按照临床和实验室标准协会指南操作。将两种化合物分别配制成 100mg/mL 的储备液，肉桂醛溶于二甲基亚砜（DMSO），戊二醛溶于双蒸水（ddH₂O），然后在无菌培养基中进行系列稀释，最低浓度至 1.56μg/mL。将培养 48h 的普通脱硫弧菌稀释至 5×10⁵CFU/mL 接入各测试管，培养 72h 后，观察培养基的浑浊度和颜色变化（FeS 沉淀导致的黑色），以确定 MIC。从无细菌生长的测试管中取 1mL 肉汤与 9mL 融化的固体培养基混合，倒入培养皿培养 72h，以确定 MBC，并计算 MBC/MIC 比值判断杀菌或抑菌效果。
3. 普通脱硫弧菌在玻璃盖玻片上的生物膜形成与破坏实验：将无菌玻璃盖玻片经 70% 乙醇处理、清洗、干燥、灭菌后，接种稀释至 OD₆₀₀为 0.007（约 1×10⁶CFU/mL）的普通脱硫弧菌菌液，在 24 孔板中静态培养 96h，期间每隔 24h 用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）观察生物膜形成情况。观察前，用无菌 PBS 清洗去除浮游细胞，然后用 0.01% 吖啶橙染色，再清洗后进行观察和分析。对于生物膜破坏实验，将培养 72h 的成熟生物膜清洗后转移至含有不同浓度肉桂醛和戊二醛（100、50、25、12.5μg/mL）的培养基中，继续培养 48h，然后用 CLSM 观察。
4. 普通脱硫弧菌在金属 coupons 上的生物膜形成与破坏实验：金属 coupons（材质为 S355J2G3）经 70% 乙醇处理、清洗、干热灭菌后，放入 12 孔板，接种 1×10⁶CFU/mL 的普通脱硫弧菌菌液，在 37°C 静态培养 72h，每隔 24h 取出三个 coupons，清洗、超声处理后进行活菌计数。对于生物膜破坏实验，选择培养 48h 的生物膜，清洗后转移至含有 100μg/mL 肉桂醛（8×MIC）的培养基中培养 48h，然后进行活菌计数，同时设置 1% DMSO 作为对照。
5. 统计分析：使用 GraphPad Prism 软件进行单因素方差分析（ANOVA），并通过 Dunn 多重比较检验评估差异显著性，P≤0.001 表示差异显著。

结果

1. 普通脱硫弧菌对肉桂醛和戊二醛的敏感性：经测定，肉桂醛和戊二醛对普通脱硫弧菌的 MIC 均为 12.5μg/mL。在该浓度下，细菌生长受到抑制，培养基浑浊度与阴性对照无差异。MBC 测定结果显示，在 MIC 浓度下无细菌生长，MBC/MIC 比值为 1，表明二者均具有杀菌活性。
   观察普通脱硫弧菌在玻璃盖玻片上的生物膜形成动态，48h 开始出现细胞聚集斑块，72h 形成厚且连续的生物膜层，96h 后生物膜开始分散。生物膜的生物量、厚度和表面积在 72h 达到最大值，分别约为 7μm³/μm²、17μm 和 3×10⁶μm²，之后因营养耗尽和代谢产物积累而下降。
2. 肉桂醛和戊二醛对预形成生物膜的影响：将 72h 成熟生物膜暴露于不同浓度的肉桂醛和戊二醛（MIC 至 8×MIC）48h 后，二者均呈现浓度依赖性地破坏生物膜。50μg/mL（4×MIC）的肉桂醛和戊二醛处理后，生物膜生物量分别减少约 90% 和 85%，表面积减少约 85% 和 80%，平均厚度减少约 60% 和 45% 。
   由于肉桂醛溶于 DMSO，为排除溶剂影响，研究了不同浓度 DMSO 对生物膜的作用。结果显示，0.125%、0.25% 和 0.5% 的 DMSO 对生物膜生物量无显著影响，1% 的 DMSO 虽使生物量和表面积显著降低，但与肉桂醛的杀菌效果相比，仍表明肉桂醛在破坏生物膜方面起主要作用。
3. 普通脱硫弧菌在金属 coupons 上的生物膜形成与破坏：在金属 coupons 上，普通脱硫弧菌生物膜在 48h 时活菌数达到约 1.5×10⁶CFU/mL，72h 降至约 1×10⁵CFU/mL。以 48h 生物膜为研究对象，用 100μg/mL（8×MIC）肉桂醛处理 48h 后，活菌计数未检测到 CFU/mL，表明肉桂醛对金属表面生物膜具有杀菌作用。而 1% DMSO 处理组与未处理组相比，活菌数无差异，说明在金属 coupons 实验中，DMSO 不影响细菌 viability。

讨论

本研究首次证明肉桂醛对普通脱硫弧菌具有良好的抗菌和抗生物膜性能，且效果与戊二醛相当，但戊二醛对环境有害，肉桂醛则具有环保优势。

以往研究表明，肉桂醛对一些常见病原菌的生长抑制浓度较高，如对大肠杆菌（Escherichia coli）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）等，MIC 通常≥250μg/mL 。而在本研究中，肉桂醛对普通脱硫弧菌的抑制和杀菌浓度低得多，仅 12.5μg/mL，且 50μg/mL 就能几乎完全破坏生物膜。这对于缓解微生物腐蚀意义重大，因为生物膜中的固着细胞比浮游细胞更难清除，传统生物杀灭剂往往需要高浓度才能起效。

与其他植物提取物成分相比，如柠檬草精油（LEO）及其主要成分柠檬醛对Desulfovibrio alaskensis的 MIC 为 170μg/mL，其他成分如芳樟醇、香叶醇等对Desulfovibrio alaskensis的 MIC 范围在 78 - 2500μg/mL，均高于肉桂醛对普通脱硫弧菌的有效浓度。

肉桂醛不仅能有效破坏生物膜，还具有作为绿色腐蚀抑制剂的特性，可在金属表面吸附形成保护膜，减缓腐蚀。此外，它还被认为是一种群体感应抑制剂，能减少生物膜形成，在与其他材料结合时可作为潜在的防污涂层。

综上所述，肉桂醛作为一种兼具抗菌和腐蚀抑制功能的天然化合物，为控制 SRB 活性和管理生物膜相关腐蚀提供了一种更安全、环保的方法，有望替代传统有害生物杀灭剂。后续研究可进一步探索其在不同环境条件下的长期效果和性能，推动其在工业领域的实际应用。