探秘沃尔巴克氏体（Wolbachia）感染果蝇：蛋白质修饰与行为变化背后的奥秘

本文聚焦沃尔巴克氏体（Wolbachia）与果蝇的相互作用。通过比较蛋白质组学，发现感染后果蝇头部和身体多种蛋白质发生翻译后修饰，其中谷氨酸脱羧酶（GAD）仅在头部被修饰。还探究了其对果蝇行为和 γ- 氨基丁酸（GABA）产生的影响，为理解宿主 - 微生物关系提供新视角。

　　

研究背景

沃尔巴克氏体（Wolbachia pipientis，简称 Wolbachia）是一种广泛存在于昆虫体内的细胞内共生菌，约 40% 的节肢动物物种都携带它。它与宿主的关系复杂，从互利共生到寄生不等。在果蝇研究中，以往多关注其对生殖系的操纵，以确保自身传播，但它也能定植于果蝇的多种体细胞组织，如肠道、脂肪体和中枢神经系统。大脑是一个特殊的定植位点，其神经元代谢需求高，而 Wolbachia 感染与果蝇的多种行为变化相关，如交配选择、攻击行为、睡眠、嗅觉反应和学习记忆能力的改变。不过，这些行为变化是否由 Wolbachia 感染或其在大脑中的定植直接导致尚不明确。随着测序和生物信息学技术的发展，多种 -omic 方法被用于研究 Wolbachia 与宿主的相互作用，但此前利用蛋白质组学研究 Wolbachia 感染对宿主影响的研究较少，且主要集中在生殖组织和细胞系的蛋白质丰度变化上。本研究旨在通过蛋白质组学技术，探究 Wolbachia 感染对果蝇体细胞组织蛋白质修饰的影响，为深入理解宿主与微生物的相互作用提供依据。

研究方法

1. 果蝇饲养：实验使用 w¹¹¹⁸果蝇品系，包括未感染和感染 Wolbachia 菌株 wMel 的果蝇，由 Dr. William Sullivan 提供。果蝇在标准玉米粉琼脂培养基上饲养，温度控制在 25°C，光照周期为 12 小时光照、12 小时黑暗。羽化当天收集果蝇，饲养 4 - 5 天至成熟，将雌蝇与其他雌蝇或雄蝇共同饲养，以获得处女蝇和交配后的雌蝇。
2. 二维差异凝胶电泳（2D - DIGE）：将果蝇按性别、交配状态和感染状态分组，分离头部和身体。用冷 1× PBS 冲洗后，加入裂解缓冲液（7 M 尿素、2 M 硫脲、10 mM HEPES pH 8.0、10 mM DTT、4% CHAPS）手动匀浆，离心收集上清液并测定蛋白质浓度。取 100 μg 蛋白质分别用 Cy3 - 和 Cy5 - NHS 最小标记 DIGE 染料标记，设置技术重复并反转标记方案以消除染料影响。进行二维凝胶电泳后，固定凝胶并成像，使用 ImageJ 软件可视化凝胶图像，用 Source Extractor（SExtractor）软件测量蛋白质斑点的相对强度，选取至少三个生物学重复中凝胶上显示一致差异的蛋白质斑点进行鉴定。
3. 蛋白质鉴定（LC - MS）：从 2D 凝胶上切下选定的蛋白质斑点，进行凝胶内消化。消化后的肽段经脱盐、分离后，用 timsTOF Pro 2 质谱仪进行分析。质谱数据通过 Bruker Parallel Search Engine in Real - time（PaSER）平台在 Uniprot 的果蝇蛋白质数据库中搜索，设置多种参数进行筛选，以鉴定蛋白质。
4. GABA 定量：采用一种基于 GABA 代谢驱动荧光化合物试卤灵合成的荧光耦合测定法。制备果蝇头部裂解液，同时准备不同浓度的 GABA 标准溶液。反应混合物包含 GABase、diaphorase、试卤灵、NADP、α - 酮戊二酸、DTT 等成分，在 96 孔板中进行反应，用 Tecan Spark 酶标仪测量荧光强度。通过标准曲线计算样品中 GABA 的含量，并根据蛋白质浓度进行归一化处理，每个样品设置三个生物学重复和两个技术重复。
5. 免疫组织化学：解剖果蝇大脑，在 PBST（含 0.3% Triton - X 的磷酸盐缓冲盐水）中固定，用 5% 正常山羊血清封闭，与抗 GABA 和抗 ELAV 的一抗孵育，再与相应的二抗孵育，最后用共聚焦显微镜观察。
6. 图像分析：利用 ImageJ 软件处理免疫组织化学图像，以 ELAV 染色为参照勾勒大脑区域，测量各通道中选定区域的平均荧光强度，并将 GABA 通道的平均强度与 ELAV 通道的平均强度进行归一化处理。
7. 嗅觉陷阱实验：制作酵母诱饵陷阱和未诱饵的对照陷阱，将果蝇按感染状态和性别分组，饥饿 2 小时后，每组 25 只果蝇放入含有陷阱的培养皿中，在温度控制的环境下用 CCD 相机记录 12 小时内果蝇的活动情况，实验在下午进行，记录时间在果蝇光暗周期的 ZT5 - ZT6 之间，实验数据由盲法统计。
8. 印防己毒素（Picrotoxin）处理：制备印防己毒素的 100 mg/mL DMF 储备液，使用时稀释至不同浓度，同时准备含相同 DMF 量的对照溶液。将滤纸浸泡在处理液和对照液中，放入空瓶。果蝇饥饿 2 小时后转移至处理瓶中 90 分钟，选择腹部变红（表明摄入处理液）的果蝇进行嗅觉陷阱实验。
9. 统计分析：使用 Microsoft Excel 和 R（v 4.3.0）进行数据分析。用 t 检验比较 DIGE 凝胶上 Wol - 和 Wol + 蛋白质的 log₂比率；用 t 检验分析果蝇大脑中 GABA 水平的差异，并进行 Bonferroni 校正；用 Cox 比例风险模型分析嗅觉陷阱实验的捕获数据，对于印防己毒素处理的果蝇捕获数据，因 “处理” 因素违反比例风险假设，使用广义线性模型（GLM）进行分析，分别和交互检验感染和处理对捕获数据的影响，分别分析酵母诱饵和未诱饵陷阱的捕获信息。

研究结果

1. 蛋白质变化：通过 2D - DIGE 分析发现，Wolbachia 感染后，果蝇头部和身体的蛋白质组发生变化。在头部鉴定出 6 个蛋白质斑点在感染前后有一致变化，这些蛋白质斑点在 2D 凝胶上呈现水平移动，表明发生了翻译后修饰（PTM），且不同蛋白质的修饰导致其等电点向酸性或碱性方向改变。经 LC - MS/MS 鉴定，这些斑点对应的蛋白质包括糖原磷酸化酶、铁调节蛋白 1B、肌醇 - 3 - 磷酸合酶、谷氨酸脱羧酶（GAD）、延伸因子 1 - γ 和甘油 - 3 - 磷酸脱氢酶（GPDH）。对蛋白质斑点的荧光强度进行量化分析，发现所有蛋白质至少有一种形式在感染组（Wol +）头部更丰富，至少有一种形式在未感染组（Wol -）头部更丰富，如 GPDH 的不同形式在感染组和未感染组的丰度差异显著。在果蝇身体的蛋白质组分析中，除铁调节蛋白（IRP1B）外，头部鉴定出的蛋白质在身体中也有类似变化，但 GAD 是个例外，它仅在头部感染后发生修饰，在身体中未观察到明显变化。
2. GABA 水平：采用荧光耦合测定法和免疫组织化学染色两种方法检测果蝇大脑中的 GABA 水平。荧光耦合测定法结果显示，感染和未感染果蝇头部的 GABA 浓度在 1.5 - 2.5 nmol/mg 蛋白质之间，未发现显著差异，但未感染的交配雌蝇头部 GABA 水平高于未感染的处女蝇，而感染雌蝇中无此差异。免疫组织化学染色结果表明，GABA 在果蝇大脑中广泛分布，感染和未感染果蝇大脑中的 GABA 含量无明显差异，且 GABA 水平不受果蝇性别和交配状态的影响。
3. 嗅觉行为变化：利用酵母诱饵陷阱评估 Wolbachia 感染对果蝇嗅觉反应的影响，同时用未诱饵陷阱监测果蝇的一般活动。结果显示，感染 Wolbachia 的雄性和交配雌蝇在酵母诱饵陷阱中的捕获比例随时间增加，高于未感染的同类果蝇，但感染也使所有组果蝇在未诱饵陷阱中的捕获率显著增加，难以确定酵母诱饵陷阱中的捕获差异是由嗅觉还是运动能力变化引起。当聚焦于实验的前 6 小时，感染的雄性和交配雌蝇在酵母诱饵陷阱中的捕获率仍显著增加，且此时感染和未感染果蝇在未诱饵陷阱中的捕获率无显著差异，表明 Wolbachia 感染影响了雄性和交配雌蝇对酵母气味的嗅觉反应。由于交配雌蝇在嗅觉实验中的总体反应更高，后续分析主要针对这一群体。
4. GABA_A受体抑制的影响：为探究 Wolbachia 感染引起的嗅觉反应改善是否依赖于 GABA 信号通路，用 GABA_A受体拮抗剂印防己毒素处理交配雌蝇。结果显示，对照处理组的捕获率与未处理实验相似，用印防己毒素处理后，果蝇在酵母诱饵陷阱中的捕获比例普遍下降，未感染果蝇的下降幅度更大。通过广义线性模型（GLM）分析，发现印防己毒素处理对未感染果蝇的捕获比例有负面影响，而对感染果蝇无显著影响，表明 Wolbachia 感染导致的交配雌蝇嗅觉诱导捕获增加不受印防己毒素抑制 GABA_A介导的传递的影响。

研究讨论

1. 研究意义：本研究首次描述了 Wolbachia 感染宿主过程中发生的翻译后修饰，这对于全面理解宿主 - 微生物相互作用至关重要。翻译后修饰可调节蛋白质的功能、稳定性、定位和相互作用，在许多细胞内细菌的生命周期以及宿主对微生物的反应中都起着重要作用。例如，耶尔森菌（Yersinia）通过表达乙酰转移酶 YopJ 抑制宿主细胞的 MAPK 信号通路，嗜肺军团菌（Legionella pneumophila）通过修饰宿主蛋白重塑肌动蛋白细胞骨架，为自身创造有利的生存环境。研究 Wolbachia 感染引起的翻译后修饰，有助于深入了解宿主 - Wolbachia 界面以及这种内共生菌的生存机制。
2. 代谢相关蛋白质修饰：在 Wolbachia 感染后差异修饰的 6 种蛋白质中，有 5 种与碳水化合物代谢和能量产生直接相关。此前研究表明，Wolbachia 可影响宿主细胞的碳水化合物代谢，如在感染的蚊子细胞系中，与糖原合成和周转相关的蛋白质水平升高，糖酵解和三羧酸（TCA）循环相关酶也上调。Wolbachia 编码糖转运蛋白，可能消耗宿主细胞内的葡萄糖，从而促使宿主增加糖原分解和碳水化合物代谢。本研究不仅在果蝇宿主中证实了这些变化，还发现了相关蛋白质的翻译后修饰，而非仅仅是丰度变化。
3. GAD 修饰的不确定性：感染后 GAD 等电点的变化暗示可能发生了磷酸化事件，但具体的翻译后修饰类型尚未确定。人类的两种 GAD（GAD67 和 GAD65）已知会发生磷酸化，且磷酸化位点不同对酶活性的影响也不同。果蝇和人类 GAD 有显著的序列同源性，但人类 GAD 的修饰位点在果蝇 GAD 中并不保守，因此无法推断 Wolbachia 感染时果蝇 GAD 修饰对其酶活性的影响。虽然在体内实验中未检测到 GAD 修饰后 GABA 水平的变化，但可能需要更精细的方法进一步研究酶的功能，例如在体外诱导 GAD 修饰并检测其活性变化，或者研究其修饰后的定位变化，因为 GAD 的定位变化可能影响细胞内 GABA 的水平和代谢。
4. GABA 的多重作用：GABA 不仅在调节果蝇行为方面发挥作用，还在代谢中具有重要功能。在系统水平上，GABA 可调节果蝇大脑中的胰岛素信号通路。大脑中的胰岛素产生细胞（IPCs）表达 GABA_B受体，GABA 能神经元与这些细胞相互作用，敲低 IPCs 中的 GABA 受体可导致对代谢应激的敏感性增加和胰岛素样肽产生增加。胰岛素信号通路又与果蝇对食物气味的嗅觉反应相关，当胰岛素水平低时，嗅觉感觉神经元被激活以启动觅食行为，胰岛素水平升高时则抑制觅食信号。Wolbachia 已被证明可增加果蝇的胰岛素信号，可能通过调节 GABA 对 IPCs 的信号传递来影响宿主的嗅觉觅食行为，且 IPCs 不表达 GABA_A受体，在本实验中未受印防己毒素处理的影响，因此需要进一步研究 Wolbachia 和 GABA 在 IPCs 周围细胞中的作用来验证这一假设。在细胞水平上，GABA 在植物和微生物中参与应对压力的代谢过程，通过 GABA 分流途径产生琥珀酸进入 TCA 循环，为细胞提供能量和代谢中间体。虽然 Wolbachia 基因组中未编码 GABA 分流途径的酶，但它可能影响宿主细胞的代谢过程，且 Wolbachia 已被证明可影响果蝇细胞的线粒体代谢，而 GABA 分流和 TCA 循环主要发生在线粒体中，因此需要更深入地研究 Wolbachia 感染时不同细胞区室中 GABA 的水平变化。
5. 研究展望：Wolbachia 与体细胞组织的相互作用在很大程度上尚未得到充分研究，尤其是在神经系统中宿主 - 微生物关系还有许多未知。本研究虽然未证实 Wolbachia 定位于神经系统的 “行为操纵假说”，但揭示了它可能通过修饰宿主代谢来适应果蝇大脑的特殊生态位，且感染引起的行为变化可能是代谢改变的结果。未来需要进一步研究来验证这些假设，深入了解 Wolbachia 与宿主的相互作用机制。