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葡萄园粉蚧（Planococcus ficus）是重要葡萄园害虫。研究人员开展了从葡萄园粉蚧中分离产几丁质酶细菌并测序其基因组的研究，得到了链霉菌属（Streptomyces）、类芽孢杆菌属（Paenibacillus）和运动芽孢杆菌（Bacillus mobilis）的基因组序列，为生物防治提供依据。
葡萄园粉蚧（Planococcus ficus）是影响全球多个国家葡萄栽培的主要害虫。本文介绍了从实验室饲养在有机笋瓜上的葡萄园粉蚧中分离出的三株产几丁质酶细菌的基因组序列。在细菌分离实验中，将单个昆虫碾碎，与 500 微升 1× 磷酸盐缓冲盐水混合，进行系列稀释后，直接接种在几丁质琼脂平板上（菌株 Streptomyces sp. MB22_4 和 Paenibacillus sp. MB22_1），或者先接种在 PD3 培养基上，再转接到几丁质琼脂平板上（Bacillus mobilis KC15） 。这三株菌在几丁质琼脂平板上生长时，周围出现透明圈，表明它们具有几丁质酶活性。
测序实验时，将菌株在 28°C、180 转 / 分钟的条件下，于液体 PD3 培养基中振荡培养过夜。取 2 毫升细菌悬液（OD600nm = 0.2 - 0.5），9000 转 / 分钟离心 3 分钟，收集细胞沉淀，用含有 1 微升 Ready-Lyse 溶菌酶（LGC Biosearch Technologies）的 180 微升 1× Tris-EDTA 缓冲液重悬，37°C 孵育 30 分钟。之后，按照 Qiagen DNeasy 提取试剂盒的操作说明进行 DNA 提取，在柱纯化前加入 RNase A 处理（20 微升 20 毫克 / 毫升的 RNase A，室温孵育 10 分钟） 。最后，用 100 微升无菌水洗脱 DNA，并使用 Quant-IT DNA 定量试剂盒（Thermo Fisher）进行定量。
在 Illumina 测序中，使用基于 PCR 的 Illumina DNA 制备试剂盒构建文库，目标插入片段大小为 280 碱基对，无需额外的 DNA 片段化或大小选择步骤。在 Illumina NovaSeq X Plus 测序仪上进行测序，产生 2×151 碱基对的双端 reads。利用 bcl-convert v4.2.4（Illumina, Inc），采用默认参数进行解复用、质量控制和接头修剪。
对于纳米孔测序，使用无 PCR 的牛津纳米孔技术连接测序试剂盒（SQK-NBD114.24）和 NEBNext 配套模块（New England BioLabs），按照制造商的规格构建文库，同样无需额外的 DNA 片段化或大小选择步骤。在 PromethION 测序仪上，使用 R10.4.1 流动池进行纳米孔测序。利用 Guppy v6.5.7（牛津纳米孔技术），在超精确（sup）和 5mC 碱基识别模型（dna_r10.4.1_e8.2_400bps_modbases_5mc_cg_sup.cfg）下，采用默认的修剪选项（去除接头、引物和条形码）进行碱基识别和解复用。使用 Porechop v0.2.4 修剪碱基识别和解复用过程中可能遗漏的纳米孔测序读段中的残留接头序列。
利用 Flye v2.9.2，采用 nano-hq 模型，从纳米孔测序读段中进行从头基因组组装。基于 6 兆碱基对的基因组大小，选择长度大于估计的 N50 的读段启动组装。使用 Pilon v1.24，以 Illumina 测序读段对初始组装结果进行抛光，默认参数设置，去除平均短读段覆盖度为 15× 或更低的长读段重叠群。最终组装的统计信息和相关数据见表格。利用 GTDB-Tk v2.3.2 和 Kbase 平台上的 GTDB R08 - RS214 参考数据库，获得分类学分类、平均核苷酸同一性、基因组完整性和污染指标。在国家生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information）数据提交平台上，使用原核基因组注释管道（Prokaryotic Genome Annotation Pipeline）进行基因组注释。
测序工作由 SeqCenter LLC 完成，分析工作借助 Kbase 平台开展。本研究由美国农业部农业研究服务局拨款项目 #2034 - 22000 - 014 - 000 - D 资助。本文提及商品名或商业产品仅为提供具体信息，不代表美国农业部的推荐或认可。美国农业部是机会均等的服务提供者和雇主。
