探秘 Novosphingobium sp. BL-52-GroH 菌株全基因组：独特双染色体架构背后的奥秘

来自密西西比大学的研究人员，为分离产鞘脂的鞘脂单胞菌目新菌株，对 Novosphingobium sp. BL-52-GroH 进行基因组研究。结果发现其有两个环形染色体和两个质粒，这为该属双染色体架构研究提供新例。

　　Novosphingobium sp. BL-52-GroH 菌株是从密西西比大学校园土壤中分离得到的。对该菌株进行纳米孔测序后发现，其基因组包含两条环形兆碱基长度的染色体和两个质粒。通过注释发现，两条染色体上均存在管家基因，这表明该 Novosphingobium 菌株是该属中又一个具有双染色体架构的例子。

该菌株是从密西西比大学格罗夫垃圾桶旁采集的土壤中分离出来的。具体操作是，将 1 克土壤与 5 毫升磷酸盐缓冲盐水（PBS）涡旋混合 15 分钟，未过滤的样本稀释 100 倍后，接种到产铁载体（siderophores）定义培养基（DMS）- 丙酮酸琼脂平板上，并使用制霉菌素处理。在新鲜的 DMS - 柠檬酸平板上再次划线培养后，得到黄色、圆形、扁平且边缘整齐的纯菌落。挑取一个纯菌落接入 5 毫升 LB Lennox 肉汤中，在室温（约 23°C，1 atm）下以中等速度振荡培养 48 小时。之后，将菌液与无菌 50% 甘油按 1:1 涡旋混合，制备成 -70°C 保存的菌种。

从保存的菌种复苏培养物中提取基因组 DNA。对于 16S 测序（美国新泽西州 Genewiz 的 16S rRNA 服务），使用 E.Z.N.A. 细菌 DNA 提取试剂盒并进行可选的珠磨处理（Omega Bio - Tek）；对于基因组测序，使用 NucleoBond 高分子量（HMW）DNA 酶解裂解方案（Macherey - Nagel），利用约 10 微升沉淀细胞，加入 10 微升溶菌酶（Omega Bio - Tek）。通过荧光法在 Qubit 上对 HMW DNA 进行定量，再用 SeraMag 磁珠浓缩，然后由供应商（美国肯塔基州 Plasmidsaurus）进行纳米孔测序。供应商使用 V14 文库制备化学方法，在 PromethION 平台上对 R10.4.1 细胞进行测序，并采用超级精确模式下的 Dorado 碱基识别，得到 162,406 条原始.fastq 基因组读数，N50 为 9,215 bp。

在 Geneious（2023.0.4 版本）软件中，对原始的 16S 正向 / 反向桑格测序读数进行修剪（错误概率限制为 0.005）并相互进行成对比对。然后，在 Geneious 中使用 Megablast 搜索比对结果，发现与核苷酸集合（nr/nt）中的 Novosphingobium sp. NJ - NJ2 - 1019（MK863544）有 99.5% 的成对匹配。原始基因组读数使用 FiltLong（0.2.1 版本）进行处理，去除长度低于 500 bp 的读数，然后保留质量得分前 98% 的读数；另外还分别设置了 1000 bp 的长度截止值和保留质量得分前 90% 读数的处理。使用 Flye（2.9 - b1778 版本）并采用纳米孔高质量设置，对 500 bp/98% 的文件进行组装，得到四个环形重叠群（平均覆盖度为 x127）。再使用 Racon（1.5.0 版本）和 Medaka（1.7.2 版本）对组装结果进行抛光，最终得到长度为 6,384,257 bp、GC 含量为 65.9% 的基因组。利用 NCBI 原核生物注释流程（GenBank 的 6.8 版本）进行注释，结果显示两条染色体共享管家基因（如 rRNA 基因）。通过 OrthoANI 工具（OAT，0.93.1 版本）与 GenBank 上所有完成或达到染色体水平组装的 Novosphingobium 基因组进行比较，表明 BL - 52 - GroH 是一个新菌株。